CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH – Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Thủy tinh hóa đã mở ra phương pháp bảo quản lạnh noãn người hiệu quả, trở thành lựa chọn "bảo tồn khả năng sinh sản" quan trọng cho phụ nữ thế kỷ 21. Ứng dụng thương mại trong trữ noãn (từ người hiến hoặc tự thân) đã trở nên phổ biến.
Mặc dù ngân hàng noãn hiến tặng ngày càng đáng tin cậy nhờ quy trình rã đông chuẩn hóa và loại bỏ người hiến tặng có chất lượng noãn kém, tuy nhiên vẫn có sự khác biệt về tỷ lệ sống và khả năng phát triển so với noãn tươi. Nguyên nhân có thể nằm ở quá trình kích thích buồng trứng và sự trưởng thành tế bào chất. Ưu điểm của IVF noãn tươi là những noãn chưa trưởng thành về tế bào chất sau chọc hút vẫn có thể tiếp tục quá trình trưởng thành in vitro trong vài giờ trước và sau khi thụ tinh. Ngược lại, noãn đông lạnh tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotective Agent - CPA) có thể ức chế các quá trình tế bào quan trọng như hoạt hóa gen, chức năng ty thể, giải phóng Ca²⁺ từ lưới nội chất và các chức năng sinh lý khác nếu quá trình đông lạnh và rã đông không tối ưu.
Nghiên cứu của Gallardo và cộng sự (2019) đã chứng minh rằng việc áp dụng phương pháp thủy tinh hóa siêu nhanh kết hợp rã đông nhanh (Ultra-fast Vitrification/Rapid Elution – UVF/RE) bằng cách giảm thiểu thời gian tiếp xúc CPA xuống còn khoảng 1 phút đã mang lại kết quả khả quan. Cách tiếp cận mới này, tập trung vào việc khử nước tế bào mà không cần tiếp xúc quá mức với CPA, hứa hẹn sẽ cải thiện đáng kể quá trình bảo quản lạnh noãn, hướng tới sự nhất quán tương đương với thủy tinh hóa phôi nang.
Với UVF/RE, hiệu quả của quá trình rã đông có thể diễn ra nhanh hơn. Các quy trình rã đông thương mại thường sử dụng dung dịch sucrose hoặc trehalose nồng độ cao và áp dụng quy trình pha loãng giảm dần (2 đến 4 bước) để giảm stress tế bào trước khi đạt đến trạng thái đẳng trương. Tuy nhiên, Schiewe và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng phôi nang người có thể sống sót sau quá trình cân bằng đẳng trương trực tiếp sau khi tiếp xúc với dung dịch rã đông. Điều này cho thấy việc rút ngắn thời gian pha loãng (1-3 phút) vẫn đảm bảo tỷ lệ sống sót cao của phôi nang sau rã đông, giúp quy trình hiệu quả về thời gian và nhẹ nhàng hơn về mặt thẩm thấu. Phôi và noãn người đã chứng minh khả năng phục hồi tốt trước stress thẩm thấu trong giai đoạn sau khi rã đông. Nhiều nhóm lâm sàng gần đây đã áp dụng quy trình rã đông một bước để tăng hiệu quả thời gian mà vẫn duy trì tỷ lệ sống và kết quả thai cao. Do đó, những lo ngại về việc rã đông nhanh gây stress quá mức cho phôi đã được chứng minh là không có cơ sở.
Trong bối cảnh nghiên cứu, các tế bào noãn ở giai đoạn GV thu được từ các chu kỳ kích thích buồng trứng và được trưởng thành trong ống nghiệm (In Vitro Maturation - IVM) được sử dụng cho mục đích đào tạo và nghiên cứu. Mục tiêu của nghiên cứu là sử dụng mô hình GV-IVM để nghiên cứu bảo quản lạnh tế bào noãn, với mục tiêu xác nhận độ tin cậy và hiệu quả của các CPA khác nhau bằng UVF/RE. Sau khi được chứng minh là an toàn và hiệu quả, các nghiên cứu tiếp theo trên noãn trưởng thành sẽ được tiến hành, hướng tới các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trong tương lai.
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Noãn người giai đoạn túi mầm (Germinal Vesicle - GV) được thu thập từ bệnh nhân (BN) IVF tại California Fertility Partners và Hanabusa IVF vào đông và hè 2023. Các phức hợp noãn được tách bằng hyaluronidase 3-4 giờ sau chọc hút, thu được 379 noãn GV đủ điều kiện thử nghiệm. Tiêu chí bao gồm BN tự thân hoặc hiến tặng thường tạo ≥ 4 noãn GV để so sánh (n=257). Các chu kỳ cho ít noãn hơn được dùng làm đối chứng nuôi cấy in vitro (n=122).
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm chứng minh rằng UVF/RE độc lập CPA có thể cải thiện tỷ lệ sống và phát triển của noãn sau rã so với noãn tươi.
Giai đoạn 1:

• Thí nghiệm 1: Noãn GV được phân ngẫu nhiên vào 2 nhóm nghiên cứu để so sánh thủy tinh hóa thông thường (CV: 12 phút ES, 1 phút VS) với UFV (1 phút ES, 1 phút VS). Sau rã đông nhanh, mỗi nhóm được chia thành pha loãng chậm (CD: 1 phút TS, 3 phút DS, 2 bước WS) hoặc rã đông nhanh (RE: 1 phút TS vào MHM-C hoặc LG-Hepes). Noãn tươi đối chứng được đánh giá song song. Đánh giá khả năng sống và sự trưởng thành về nhân của noãn GV.
• Thí nghiệm 2: Đánh giá dung dịch EG không DMSO cho thủy tinh hóa. So sánh CV (5 phút V1, 3 phút V2, 1 phút V3) và UFV (1 phút V1, 1 phút V3) trên Cryotop. Sau rã đông nhanh, cả hai nhóm được xử lý RE (1 phút TS) rồi cân bằng đẳng trương. Noãn tươi đối chứng được theo dõi.

Giai đoạn 2:
Đánh giá lại các phương pháp Giai đoạn 1 trên noãn GV bỏ và noãn đông lạnh hiến tặng. Tập trung vào đánh giá trưởng thành tế bào chất, bên cạnh khả năng sống và phát triển (trưởng thành nhân). Noãn tươi đối chứng được đánh giá cùng với noãn GV xử lý thủy tinh hóa.
Thí nghiệm 1 (Giai đoạn 2): Đánh giá tính toàn vẹn thoi vô sắc của noãn MII trưởng thành bằng Polscope.
Đánh giá sự sống và trưởng thành sau thủy tinh hóa
Sau rã, khả năng sống của noãn được đánh giá chủ quan dựa trên phản ứng thẩm thấu, tính toàn vẹn màng và màu sắc tế bào chất khi đặt vào đĩa nuôi cấy. Noãn được ủ ở 37°C và đánh giá sự trưởng thành sau 24h và 48h (thoái hóa, GV, MI, MII). Các đánh giá này do một chuyên viên phôi học có kinh nghiệm thực hiện.
Trong GĐ2-TN1, thoi vô sắc của noãn MII trưởng thành sau 24h và 48h rã được phân tích bằng kính hiển vi ánh sáng phân cực.
Kiểm định ANOVA được dùng để so sánh độ trễ thoi vô sắc. Phân tích Chi bình phương được dùng để so sánh tỷ lệ sống sót và trưởng thành giữa các phương pháp điều trị (CV so với UFV), với p < 0,05 là có ý nghĩa thống kê.
 
KẾT QUẢ
Phân tích TN1 cho thấy tỷ lệ sống của noãn UFV (96-98%) tương đương noãn tươi (thoái hóa tự phát 3,2%). Trái lại, noãn CV/CD và CV/RE có tỷ lệ sống ban đầu thấp hơn (p≤0,03; 78% và 70%). Sau +24h, tất cả nhóm giảm thêm 2-4% sống sót. Trong số noãn GV còn nguyên vẹn, noãn UFV/RE có tỷ lệ trưởng thành MII sau +18-24h tương đương noãn tươi (41,7% so với 43,3%), và cao hơn (p≤0,05) so với cả hai nhóm CV (20,5-23,7%). Các nhóm CV/CD và CV/RE có tỷ lệ chuyển đổi MI cao hơn ở +24h (42,1% và 48,7%) so với 20-25,5% ở các nhóm khác (p=0,005 đến 0,05). Ở +48h, không có khác biệt về trưởng thành (52,6-58,3% MII).
Trong TN2, dung dịch bảo vệ lạnh không DMSO cho tỷ lệ sống và trưởng thành thấp hơn sau UFV/RE (88%/39%), tương đương CV/RE (92%/48%; p=0,64/P=0,57)
Phân tích bằng kính hiển vi ánh sáng phân cực cho thấy tính toàn vẹn hình thái của thoi vô sắc không khác biệt đáng kể giữa các nhóm sau 24h (80-100%) và 48h (86,7-100%) sau rã.
 
THẢO LUẬN
Nghiên cứu này xác nhận tính nhất quán của UFV cho noãn người, giải quyết vấn đề độc tính CPA do cân bằng quá mức. Gallardo (2018) chứng minh thời gian cân bằng tối thiểu (1 phút với 7,5% EG/7,5% DMSO) đủ để loại bỏ nước nội bào mà không gây hại, đạt 100% sống sót sau UFV. Nghiên cứu trên chuột (Cho và cộng sự, 2024) cũng ủng hộ UFV so với CV. Mô hình GV xác nhận độ tin cậy và hiệu quả của UFV trong việc giảm ly giải tế bào sau rã đông.
Noãn GV là mô hình tốt để đánh giá UFV/RE. So sánh ngẫu nhiên cho thấy tỷ lệ sống của CV/CD tương đương báo cáo lâm sàng (70-80%), trong khi UFV đạt >95% với dung dịch EG/DMSO tiêu chuẩn. UFV/RE cho tỷ lệ sống cao, noãn trưởng thành tương đương đối chứng. Noãn CV bị chậm trưởng thành so với UFV.
Tỷ lệ sống giảm ở noãn CV có thể do thay đổi tính thấm màng và độc tính CPA. UFV giảm thiểu vấn đề này do thời gian tiếp xúc CPA ngắn hơn. CPA không chứa DMSO cho tỷ lệ sống tốt với CV/RE nhưng thấp hơn với UFV, cho thấy cần tối ưu hóa thời gian tiếp xúc EG. Nghiên cứu khác (Liebermann và cộng sự, 2024b) cũng báo cáo tỷ lệ sống cao với UFV sử dụng các CPA thương mại khác nhau.
UFV là giải pháp tiềm năng cho bảo quản lạnh noãn. Bằng cách tập trung vào mất nước tế bào và hạn chế tiếp xúc CPA trong thời gian tối ưu, UFV có thể cải thiện tỷ lệ sống và chức năng. Nghiên cứu sơ bộ trên noãn trưởng thành cho thấy tỷ lệ sống 100%, thoi vô sắc bình thường và phát triển tốt. UFV hứa hẹn nâng cao độ tin cậy của bảo quản lạnh noãn.
 
Tài liệu tham khảo: Schiewe et al (2024). Ultra-fast vitrification and rapid elution of human oocytes: part I. germinal vesicle model validation. Reproductive BioMedicine Online, 49(6), 104691.

Từ khóa: bảo quản lạnh, thuỷ tinh hoá siêu nhanh, rã đông nhanh, túi mầm