CVPH. Phạm Duy Tùng – IVFMD Tân Bình
 
Giới thiệu
 Thủy tinh hóa đã trở thành phương pháp đông lạnh phổ biến trong hỗ trợ sinh sản đối với noãn nhờ tỷ lệ sống sau rã đông cao và khả năng ngăn chặn sự hình thành đá nội bào. Kể từ khi được chuẩn hóa vào đầu những năm 2010, thủy tinh hóa đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc bảo tồn khả năng sinh sản ở bệnh nhân ung thư, trì hoãn việc sinh con có chọn lọc và hiến tặng noãn. Các quy trình thông thường hiện nay sẽ cho noãn tiếp xúc tuần tự với các chất bảo quản lạnh (cryoprotectants - CPA) với nồng độ khác nhau trong 12–15 phút, quá trình này sẽ giúp giảm lượng nước nội bào và ngoại bào có trong noãn để giảm hình thành tinh thể đá. Đồng nghĩa với việc noãn sẽ phải tiếp xúc với môi trường có áp suất thẩm thấu cao, vốn là một điều kiện có khả năng gây hại cho noãn. Các nghiên cứu trước đây đều chỉ ra độc tính của CPA tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc với phôi và noãn. Sự nghiêm ngặt về mặt thời gian tiếp xúc của noãn trong từng loại môi trường cũng làm gia tăng gánh nặng về quy trình thực hiện cũng như kỹ thuật của chuyên viên phôi học. Điều này đặc biệt đúng với những trung tâm có số chu kỳ điều trị lớn.
 Nhiều nghiên cứu trước đây đề xuất giảm thời gian tiếp xúc với CPA (có nghiên cứu đề xuất ít nhất trong 1 phút), dựa vào các kết quả từ mô hình mô phỏng quá trình khuếch tán của nước từ trong tế bào ra ngoài với thời gian ngắn hơn đáng kể so với các phương pháp truyền thống. Mặc dù cho ra các kết quả đầy hứa hẹn, các quy trình đề ra vẫn chưa được đánh giá tiền lâm sàng một cách toàn diện về các kết quả quan trọng như tỷ lệ thụ tinh, sự phát triển của phôi và trẻ sinh sống. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá các phương pháp thuỷ tinh hoá nhanh (fast vitrification - FV) và làm ấm nhanh (fast warming – FW) mới được phát triển để giảm thời gian noãn tiếp xúc với các CPA nhưng vẫn đảm bảo được tiềm năng phát triển. Nghiên cứu được thực hiện trên hai mô hình động vật (chuột và thỏ) nhằm đánh giá về hoạt động của thoi vô sắc, khả năng sống và phát triển sau thụ tinh cũng như khả năng phát triển sau chuyển phôi so với phương pháp tiêu chuẩn. Dựa trên các kết quả đó, mô hình dự đoán trên người được phát triển và thử nghiệm trên noãn của bệnh nhân không được sử dụng trong điều trị để đánh giá khả năng sống sót trước khi ứng dụng trong lâm sàng.
 
Phương pháp
Đánh giá tiền lâm sàng được thực hiện trên noãn trưởng thành (ở giai đoạn metaphase II – MII) từ chuột, thỏ và noãn không sử dụng cho mục đích điều trị ở người. Trên mô hình động vật, noãn được phân bổ ngẫu nhiên vào 3 nhóm theo các tổ hợp phương pháp trữ và rã đông khác nhau: SV/SW (trữ và rã đông tiêu chuẩn – standard vitrification and warming), SV/FW (trữ đông tiêu chuẩn và rã nhanh - standard vitrification and fast warming) hoặc FV/FW (trữ và rã đông nhanh – fast vitrification and warming). Noãn sau khi rã đông sẽ được thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) ở các mô hình động vật. Sau khi kết hợp, hợp tử sẽ được nuôi trong điều kiện tối ưu cho từng loài. Trên chuột phôi nang chất lượng tốt sẽ được chuyển và theo dõi đến khi con non ngừng sữa mẹ.
Quy trình FV được đề xuất noãn sẽ được tiếp xúc với môi trường cân bằng (Equilibrium solution – ES) trong 1 phút, sau đó chuyển qua hai môi trường thuỷ tinh hoá (Vitrification solution -VS) (VS1, VS2) trong 30 giây). Quy trình FW giảm thời gian rã đông xuống còn 1 phút trong môi trường rã (Thawing solution – TS) ở 37^oC, sau đó chuyển trực tiếp vào môi trường nuôi mà không thông qua các bước pha loãng và rửa như trong quy trình tiêu chuẩn.
Nhóm nghiên cứu sẽ đánh giá tỷ lệ noãn sống sau rã đông, tính toàn vẹn của thoi vô sắc, khả năng thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang trên chuột. Tỷ lệ noãn sống sau rã và sự phát triển của phôi sau ICSI trên thỏ. Tỷ lệ noãn sống sau rã đông đối với noãn người cũng như đánh giá lại mô hình dự đoán tính thấm của màng đã được thiết lập trước đây. Cỡ mẫu được tính toán để có sức mạnh thống kê nhằm phát hiện sự khác biệt ≥10% về tỷ lệ sống và ≥20% về tỷ lệ sinh.
 
Kết quả
Kết quả cho thấy quy trình FV/FW mới cho kết quả tương đương và đôi khi vượt trội hơn so với quy trình SV/SW thường quy. Trên mô hình chuột, FV/FW cho tỷ lệ sống cao nhất (97,2%), cao hơn có ý nghĩa thống kê so với SV/FW (91,7%, P = 0,008) và tương đương với SV/SW (94,2%). Tất cả các nhóm đều cho thấy sự toàn vẹn của thoi vô sắc và sự sắp xếp của nhiễm sắc thể bình thường (≥94%), tương tự như nhóm đối chứng.
 Sau ICSI, tỷ lệ phân chia hai tế bào và tỷ lệ phôi nang vẫn ở mức cao và tương đương giữa các quy trình. Tỷ lệ hình thành phôi nang ở các nhóm lần lượt là 80,9% (FV/FW), 83,4% (SV/SW), và 75,9% (SV/FW), tỷ lệ này ở nhóm đối chứng noãn tươi là 86,4%. Số lượng tế bào trung bình của phôi nang dao động từ 120 đến 130 tế bào, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm.
 Kết quả chuyển phôi củng cố thêm tiềm năng phát triển của noãn sau rã đông. Từ 93 phôi nang trong nhóm FV/FW, đã có 36 chuột con sống được sinh ra (tỷ lệ sinh sống 38,7%), không khác biệt đáng kể so với SV/SW (47,8%) hay SV/FW (43,2%). Không có sự bất thường trong phát triển được ghi nhận trong quá trình trưởng thành của chuột con.
 Trên noãn thỏ, FV/FW vượt trội hơn SV/FW về sự phát triển phôi nang (28,6% so với 13,6%) và cao hơn một chút so với SV/SW (22,2%). Số lượng tế bào trên mỗi phôi nang cao nhất ở nhóm FV/FW (357 tế bào), vượt qua cả nhóm đối chứng noãn tươi (208 tế bào), mặc dù vậy số lượng tế bào có sự khác biệt lớn giữa mỗi phôi.
 Trên noãn người, mô hình tính toán tính thấm của màng dự đoán tính an toàn về sự thay đổi áp suất thẩm thấu trong quy trình trữ rã nhanh. FV/FW giảm thể tích noãn xuống còn 37,6% so với kích thước đẳng trương, trong khi SV/SW đạt 50,7%. Xác nhận bằng thực nghiệm cho thấy: trong số 103 noãn MII người được thủy tinh hóa bằng FV/FW, tỷ lệ sống là 100% sau 2 giờ và 97,1% sau 24 giờ rã đông — tương đương với SV/FW (97% sau 2 giờ; 94,1% sau 24 giờ). Noãn không có dấu hiệu trương phồng hay tăng áp lực thẩm thấu.
 
Nhìn chung, cả mô hình động vật và người đều chứng tỏ rằng việc thủy tinh hóa nhanh và rã đông nhanh giúp giảm đáng kể thời gian thực hiện quy trình—từ 12–15 phút xuống còn khoảng 2 phút cho thủy tinh hóa, và từ 10 phút xuống còn 1 phút cho rã đông—trong khi vẫn duy trì sự toàn vẹn về mặt tế bào và tiềm năng phát triển.
 
Kết luận
 Kết quả của nghiên cứu cho thấy tiềm năng của quy trình trữ lạnh và rã đông nhanh giúp giảm tổng thời gian thực hiện quy trình từ hơn 20 phút xuống chỉ còn 3 phút mà không ảnh hưởng đến tỷ lệ noãn sống sau rã, tính toàn vẹn của thoi vô sắc cũng như tiềm năng phát triển của noãn. Điều này giải quyết được những lo ngại về ảnh hưởng của độc tính và thay đổi về áp suất thẩm thấu khi tiếp xúc với CPA trong thời gian dài. Kết quả của nghiên cứu cho thấy FV/FW cho tỷ lệ sống sau rã cao nhất và khả năng phát triển tương đương với quy trình SV/SW. Mặc dù vậy, tỷ lệ sinh sống lại thấp hơn đôi chút và cần được nghiên cứu kỹ lưỡng. Mô hình dự đoán cho thấy noãn người cho thấy sự thay đổi áp suất thẩm thấu an toàn trong giới hạn sinh lý. Nhìn chung đây là một phương pháp hứa hẹn để cải tiến các quy trình trữ đông hiện tại, nhất là đối với những trung tâm có số lượng bệnh nhân lớn.
 Do đây là nghiên cứu tiền lâm sàng với kết quả chủ yếu dựa trên mô hình động vật và cỡ mẫu để đánh giá sự khác biệt về tỷ lệ sinh sống trên chuột tương đối thấp. Hơn nữa, noãn người cũng không được đánh giá về khả năng thụ tinh và tiềm năng phát triển. Những nghiên cứu tiếp theo sẽ cần được thực hiện để đánh giá về tính an toàn, tính lặp lại cũng như kết quả thai trên người trong các thử nghiệm lâm sàng.
 
 Nguồn: Costa-Borges, N., Matia-Algué, Q., Coello, A., Mestres, E., Acacio, M., Flores-Saiffe Farias, A., Castello, C., Gallardo, M., Chavez-Badiola, A., Marco-Jiménez, F., Cobo, A., & Cohen, J. (2025). Preclinical validation of fast oocyte vitrification and warming protocols with comparable efficiencies to a standard method. Human reproduction (Oxford, England), 40(6), 1066–1076. https://doi.org/10.1093/humrep/deaf069