ThS. Võ Như Thanh Trúc – IVFAS

Giới thiệu
Ti thể mất chức năng do các đột biến gây bệnh trên DNA bộ gene (nDNA – nuclear DNA) hoặc DNA ti thể (mtDNA – mitochondrial DNA) và có thể gây ra các bệnh lý ở nhiều hệ cơ quan trong cơ thể. Những bệnh lý do mất chức năng ti thể hầu như không thể chữa khỏi, và các liệu pháp chữa trị hiện tại chỉ đơn thuần mang bản chất là các phương pháp kiểm soát triệu chứng. Đối với những phụ nữ mắc phải các bệnh lý do mất chức năng ti thể, nguy cơ họ truyền các ti thể khiếm khuyết chức năng cho cá thể đời con là rất lớn. Do đó, một số phương pháp hỗ trợ sinh sản có thể được cân nhắc chỉ định cho những bệnh nhân này như thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) với chu kì xin noãn với điều kiện người hiến noãn không mang các bệnh lý liên quan đến mất chức năng ti thể; hoặc chỉ định thực hiện TTTON kết hợp phân tích di truyền trên phôi tiền làm tổ (PGT – preimplantation genetic testing) và xét nghiệm chẩn đoán tiền sinh (PND – prenatal diagnosis). Tuy nhiên, ở các trường hợp phát hiện thai nhi mắc bệnh lý liên quan đến mất chức năng ti thể sau khi thực hiện PND, bệnh nhân lại phải đối mặt với quyết định khó khăn trong việc quyết định vẫn tiếp tục giữ thai hay kết thúc thai kì. Chính vì thế, PGT trở thành phương pháp chủ chốt trong việc chọn lọc ra phôi thực sự khoẻ mạnh để sử dụng.
 
PGT nhằm phát hiện các bệnh lý mất chức năng ti thể do đột biến trên nDNA được thực hiện bằng cách khảo sát sự hiện diện của các đột biến gây bệnh đã biết. PGT đối với trường hợp bệnh lý mất chức năng ti thể do đột biến trên mtDNA chủ yếu dựa vào định lượng mtDNA trong các phôi bào. Điều quan trọng cần chú ý là ở các cá thể mang đột biến mtDNA thể ẩn có thành phần ti thể dị dưỡng (vừa mang ti thể khoẻ mạnh, vừa mang ti thể đột biến), và bệnh lý chỉ xảy ra khi số lượng ti thể đột biến vượt ngưỡng tỉ lệ cho phép trong tế bào. Do đó, không chỉ những phôi không mang đột biến trên mtDNA mà những phôi có tỉ lệ đột biến thấp cũng có thể được sử dụng. Các báo cáo cho thấy tỉ lệ ti thể đột biến giữa các phôi có nguồn gốc từ cùng một cặp bố mẹ là khác nhau, có lẽ là hệ quả của giả thuyết thắt cổ chai trong di truyền ti thể (mitochondrial bottleneck) xảy ra trong quá trình phát sinh giao tử sinh noãn, từ noãn nguyên bào đến giảm phân tạo noãn thành công.
 
Các phương pháp hiện nay được sử dụng để phân tích PGT đối với các bệnh lý do đột biến mtDNA thường ứng dụng kỹ thuật phân tích đa hình trên đoạn dài do cắt giới hạn (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism) hoặc phân tích đột biến phát hiện các đột biến điểm hoặc mất đoạn nhỏ (ARMS – Amplification-Refractory Mutation System). Trong phương pháp RFLP, mtDNA sẽ được cắt thành các phân mảnh bằng các enzyme cắt giới hạn ở các vị trí nhất định biết trước, sau đó dùng phương pháp điện di và so sánh khác biệt giữa kích thước các phân đoạn do sự khác biệt bởi các trình tự base tại các vị trí cắt giới hạn. Phương pháp ARMS, đột biến trên mtDNA được nhắm mục tiêu bởi mồi hoặc đầu dò cụ thể hoặc bởi một enzyme cắt giới hạn dạng endonuclease và sau đó thực hiện so sánh dựa vào kết quả điện di hoặc PCR (Polymerase Chain Reaction). Tuy nhiên, những phương pháp này có kỹ thuật thực hiện khá phức tạp và khó kết hợp các quy trình chẩn đoán khác, ví dụ như quy trình phát hiện lệch bội trên phôi.
 
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu của Spath K và cộng sự (2021) thiết kế một phương pháp kết hợp PGT phát hiện lệch bội và PGT phát hiện bệnh lý liên quan đến mtDNA. Trong các quy trình PGT phát hiện lệch bội, toàn bộ vật chất di truyền thu nhận từ mẫu sinh thiết phôi đều phải trải qua quy trình WGA (Whole Genome Amplification) nên nghiên cứu cũng đề xuất ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới để có thể kết hợp phân tích song song các bất thường lệch bội và phát hiện các bất thường trên mtDNA. Nghiên cứu trình bày kết quả ứng dụng phương pháp NGS phân tích song song bất thường lệch bội trên phôi và bất thường mtDNA trên 4 bệnh nhân, liên quan đến hội chứng Leigh gây ra bởi đột biến m.8993T>G hoặc m.10191T>G hoặc bệnh cơ ti thể do đột biến m.3243A>G.
 
Nghiên cứu kí hiệu 4 bệnh nhân là các trường hợp A, B, C và D. Các bệnh nhân trong nghiên cứu này không có tiền sử gia đình mắc bệnh do đột biến mtDNA. Bệnh nhân A, B và C có ghi nhận các cá thể con mắc hội chứng Leigh. Con gái của bệnh nhân A và con trai của bệnh nhân B có tỉ lệ ti thể bệnh tương ứng là 100% và 96% đối với đột biến m.8993T>G. Con gái bệnh nhân C có thành phần ti thể dị dưỡng, tỉ lệ 78% đối với đột biến m.10191T>G. Bệnh nhân A, B, C và mẹ của bệnh nhân B được phân tích di truyền và cho kết quả mức độ đột biến khoảng 56% từ mẫu máu của bệnh nhân A, các bệnh nhân còn lại không phát hiện được các đột biến hiện diện ở con của họ. Bệnh nhân D không có con và đang trải qua PGT do có tỉ lệ khoảng 28% đột biến m.3243A>G, có triệu chứng mắc bệnh cơ ti thể. Mẹ và anh trai của D không xét nghiệm di truyền nhưng có dấu hiệu giảm thính lực và thị lực – các biểu hiện này được cho là có liên quan đến đột biến m.3243A>G.
 
Hệ thống DNA SurePlex (Illumina) được sử dụng cho WGA. Sau đó, sản phẩm WGA được phân tích PGT-A bằng phương pháp aCGH (aneuploidy Comparative Genomic Hybridization) hoặc NGS. Đối với PGT cho các đột biến trên mtDNA, các locus đột biến đặc hiệu cho từng bệnh nhân được khuếch đại tín hiệu bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được giải trình tự bằng phương pháp Torrent.
 
Kết quả
Độ chính xác của xét nghiệm định lượng đột biến mtDNA đã được xác nhận trong nghiên cứu. Thử nghiệm tương thích với PGT-A và một nửa số phôi được thử nghiệm ghi nhận được các bất thường lệch bội. Các đột biến chủ yếu được phát hiện trong khoảng 40% các phôi sinh thiết từ bệnh nhân A và D nhưng không phát hiện ở bệnh nhân B và C. Bệnh nhân B có con sinh sống khoẻ mạnh từ chuyển phôi PGT và bệnh nhân C có con sinh sống khoẻ mạnh từ thụ thai tự nhiên. Đột biến m.8993T>G thể hiện sự phân ly không đều trong khi mức đột biến m.3243A>G tương đối thấp và có khả năng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi.
 
Kết luận
Do có thể phát hiện được tỉ lệ phôi lệch bội ở độ chính xác cao, các chiến lược cung cấp xét nghiệm có thể kết hợp phân tích PGT cho cả vấn đề lệch bội trên phôi và cho cả phát hiện các đột biến mtDNA có thể mang đến nhiều lợi ích hơn so với các phương pháp chỉ đơn thuần là phát hiện lệch bội hoặc chỉ đơn thuần phát hiện các đột biến mtDNA. Những phụ nữ có thành phần dị dưỡng ti thể có nguy cơ cao tạo ra các cá thể đời con mang các bất thường mtDNA mặc dù các đột biến này không thể tìm thấy bởi các xét nghiệm sử dụng nguồn tế bào sinh dưỡng như tế bào máu ngoại vi của những phụ nữ này. Cần có thêm các nghiên cứu để có thể khẳng định rõ ràng hơn hiệu quả của các xét nghiệm này trên quần thể bệnh nhân đa dạng hơn về các tình trạng bệnh lý ti thể khác nhau, để có thể ứng dụng rộng rãi hơn kỹ thuật xét nghiệm này trong tương lai.
 
Nguồn: Spath K, Babariya D, Konstantinidis M, Lowndes J, Child T, Grifo JA, Poulton J, Wells D. Clinical application of sequencing-based methods for parallel preimplantation genetic testing for mitochondrial DNA disease and aneuploidy. Fertil Steril. 2021 Jun;115(6):1521-1532. doi: 10.1016/j.fertnstert.2021.01.026. Epub 2021 Mar 19. PMID: 33745725.

Từ khóa: PGT, mtDNA, NGS, phôi, lệch bội, ti thể