CVPH. Chu Khánh Linh - IVF Vạn Hạnh

Cấu trúc của PLCζ và cấu tạo các miền
PLCζ là đồng dạng PLC của động vật có vú nhỏ nhất được xác định cho đến nay (kích thước ∼70–75 kDa), với cấu trúc miền đơn giản nhất. Tuy nhiên, với đặc tính sinh hóa đặc biệt của PLCζ, nó được xem là protein duy nhất có hiệu quả trong việc kích thích Ca²⁺ ở noãn so với các đồng dạng PLC khác.

Cấu trúc PLCz gồm: vùng EF-hand là vùng quan trọng để tạo ra độ nhạy cảm với canxi cao, cho phép PLCζ hoạt động ở mức Ca²⁺ nghỉ sau khi tinh trùng dung hợp vào noãn. Vùng xúc tác X và Y, vùng chịu trách nhiệm cho hoạt động của enzym (thủy phân PIP₂) nhờ tương tác tĩnh điện. Tiếp theo là vùng C2 tương tác trực tiếp với phospholipid màng, cụ thể là PI(3)P và PI(5)P. Cuối cùng, trình liên kết XY được đề xuất là vùng bám vào của PLCζ khi tương tác với PIP₂.

Vai trò của PLCζ trong hoạt hóa noãn
Sau quá trình dung hợp của noãn và tinh trùng, sự gia tăng nồng độ Ca²⁺ tự do trong noãn tạo nên sóng dao động Ca²⁺ kéo dài được xem là sự kiện quan trọng nhất để hoạt hóa noãn. Trong vài thập kỉ qua, một số phân tử có nguồn gốc từ tinh trùng được giả thiết tạo nên đợt sóng Ca²⁺ đó, nhưng đến năm 2002, Saunders và cộng sự mới phát hiện ra phospholipase zeta (PLCζ), protein đáp ứng tất cả các tiêu chí tiên quyết của yếu tố tinh trùng tạo ra dao động Ca²⁺ khi thụ tinh ở động vật có vú. Tinh trùng sau khi dung hợp với noãn, yếu tố PLCζ được tiết vào tế bào chất, thủy phân chất nền phospholipid liên kết màng PIP₂, kích hoạt con đường tín hiệu InsP₃ tạo nên sóng dao động Ca²⁺ từ đó giúp noãn được hoạt hóa và bước đầu phát triển phôi sớm.

Gần đây, hai nghiên cứu độc lập của Hachem và Nozawa thực hiện thí nghiệm trên chuột bị “knock-out” gen PLCζ bằng phương pháp CRISPR/Cas9 đã cho kết quả là chuột đực vẫn có khả năng sinh sản, mặc dù số lượng PLCζ bị giảm đáng kể (∼25%). Điều thú vị là cả hai nghiên cứu đều chỉ ra rằng tinh trùng thiếu protein PLCζ chức năng không thể tạo ra Ca²⁺ khi ICSI noãn chuột. Tuy nhiên, khi thực hiện IVF với tinh trùng như vậy, các sóng Ca²⁺ được tạo ra dù không điển hình và dao động chậm (số lượng và tần số thấp hơn) so với điều kiện sinh lý bình thường. Từ những kết quả như vậy, có thể tinh trùng có chứa phân tử thứ hai có hoạt tính giải phóng Ca²⁺, mặc dù hoạt tính yếu hơn PLCζ. Để có thể sáng tỏ hơn thì cần các nghiên cứu trong tương lai về lĩnh vực này. Dù vậy, hai nghiên cứu trên cũng đại diện cho các nghiên cứu cơ bản ủng hộ quan điểm rằng PLCζ là kích thích sinh lý chính kích hoạt dao động Ca²⁺, đảm bảo sự hoạt hóa noãn.

Vị trí PLCζ ở động vật có vú
Các mRNA của phospholipase C zeta được xác định trong giai đoạn đầu và giai đoạn cuối của quá trình sinh tinh ở chuột và lợn. Aarabi và cs., 2012 đã chỉ ra rằng PLCζ được tích hợp như một phần của acrosome trong giai đoạn Golgi của quá trình hình thành tinh trùng ở người và chuột và mức độ PLCζ giảm dần trong suốt quá trình kéo dài tinh trùng. Tuy nhiên, vị trí cụ thể vẫn còn khó xác định ở các tế bào sinh tinh khác nhau trong tinh hoàn ở nhiều loài động vật khác nhau, đặc biệt ở người. Vì vậy, nhiều phương pháp nhằm xác định vị trí của PLCζ ra đời, trong đó, phương pháp tạo các kháng thể đa dòng PLCζ đặc hiệu với acrosome ở người, chuột và lợn, thể hiện tính nhất quán cao đối với cả PLCζ tái tổ hợp và tự nhiên. Bằng phương pháp này, Kashir và cs., 2017 đã xác định được PLCζ nằm trong vùng acrosome và sau acrosome, vùng acrosome và nhân, vùng sau acrosome và nhân tương ứng ở tinh trùng chuột, người và lợn. Việc xác định vị trí của PLCζ ở tinh trùng giúp làm rõ mối quan hệ giữa các thông số sinh sản của nam giới có liên quan đến PLCζ hay không, từ đó có các hướng điều trị cho từng đối tượng bệnh nhân.

Các bất thường do PLCζ dẫn đến vô sinh nam
Vô sinh ước tính ảnh hưởng đến khoảng 15% các cặp vợ chồng, trong đó vô sinh nam ảnh hưởng đến 7% nam giới trên toàn thế giới. Nguyên nhân di truyền của vô sinh nam được ước tính là cơ sở cho 30% các trường hợp như vậy, trong đó khoảng 50% trường hợp vô sinh nam vẫn không giải thích được. Xem xét tầm quan trọng của PLCζ đối với quá trình thụ tinh, các khiếm khuyết trong quá trình hoạt hóa noãn, và mức độ biểu hiện của protein PLCζ cho thấy rằng sự thiếu hụt PLCζ có thể là nguyên nhân dẫn đến các trường hợp vô sinh nam. Hơn nữa, các đột biến trong các vùng cấu trúc PLCζ cũng ảnh hưởng đến thất bại hoạt hóa noãn và gây vô sinh. Theo nghiên cứu của Kashir và cs., 2011, đột biến trong vùng xúc tác hoạt động của PLCζ gây phá vỡ sự gấp cấu trúc protein cục bộ, từ đó giảm hoạt tính của PLCζ khiến sóng dao động Ca²⁺ bất thường và cuối cùng noãn không được hoạt hóa. Điều nữa là đột biến này được báo cáo ở thể dị hợp tử, nghĩa là chúng đến từ cả bố và mẹ bệnh nhân, đây là lần đầu tiên cho thấy rằng đột biến mất hoạt tính do mẹ di truyền có thể dẫn đến vô sinh nam.

Một dạng đột biến khác nằm trong vùng C2 của PLCζ được báo cáo bởi Escoffier và cs., 2016 từ hai anh em hiếm muộn. Điều thú vị là thể đột biến PLCζ này thể hiện hoạt tính enzym tương tự như PLCζ bình thường, nhưng ái lực liên kết giảm đáng kể với các liposome chứa PI(3)P và PI(5)P từ đó ngăn chặn sự hoạt hóa noãn. Quan trọng hơn, đột biến PLCζ đồng hợp tử này phát hiện sau khi giải trình tự toàn bộ exomic và chúng chỉ ra rằng sự thiếu vắng hoặc khiếm khuyết trong chỉ riêng protein PLCζ là đủ để ngăn chặn sự hoạt hóa noãn.

Gần đây, Torra-Massana và cs., 2019 đã báo cáo sáu đột biến PLCζ mới sau khi sàng lọc một nhóm thiếu hụt hoạt hóa noãn. Cả 5 trong số đó là đột biến lệch bội đơn nucleotide nằm trong EF -hands, vùng xúc tác X và C2, trong khi đột biến thứ sáu là một đột biến dịch chuyển khung tạo ra một protein bị cắt ngắn tại vùng liên kết XY. Tất cả đều có tác động có hại lên hoạt động của PLCζ trong noãn, nhưng vẫn cần phân tích sinh hóa sâu hơn để xác định các biến thể và ảnh hưởng của chúng trong tinh trùng và noãn. Tuy nhiên, hiện nay rõ ràng là các đột biến có hại trong PLCζ có thể phổ biến hơn những gì đã nghĩ trước đây, không chỉ xuất hiện ở vị trí hoạt động xúc tác, mà còn ở các vùng điều hòa quan trọng khác của protein tinh trùng thiết yếu này, gây ảnh hưởng đến liên kết màng và chất nền của nó, độ nhạy Ca²⁺, cũng như hoạt tính enzym của nó.

Chất lượng phôi có thể bị ảnh hưởng trực tiếp bởi PLCζ và khả năng hoạt hóa noãn. Bên cạnh đó, tần số và biên độ dao động của Ca²⁺ đã được chứng minh là đóng một vai trò quan trọng trong quá trình nén và hình thành phôi nang. Vì vậy, các bất thường về mức biểu hiện PLCζ của tinh trùng có thể không chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới mà còn liên quan đến hoạt hóa noãn, và sự phát triển của phôi ở giai đoạn sớm.

Ứng dụng lâm sàng của PLCζ và các định hướng trong tương lai
Hiện nay, các trường hợp hoạt hóa noãn thất bại được giải quyết trên lâm sàng bằng cách sử dụng hỗ trợ hoạt hóa noãn (AOA), liên quan đến việc giải phóng Ca²⁺ qua các chất nhân tạo trung gian. Các ion Ca²⁺ như ionomycin, calcimycin hiện đang được sử dụng để khắc phục tình trạng không thụ tinh không rõ nguyên nhân ở các cặp vợ chồng, những người liên tục thất bại chu kỳ ICSI. Gần đây, một phân tích tổng hợp chỉ ra rằng việc sử dụng ion Ca²⁺ đã cải thiện đáng kể tỷ lệ thụ tinh và làm tổ trong ICSI. Tuy nhiên, các ion này tạo ra một đợt sóng Ca²⁺ duy nhất thoáng qua, không giống như điều kiện sinh lý nội sinh trong quá trình thụ tinh bình thường. Tuy nhiên, phương pháp tiêm PLCζ tái tổ hợp ở người mang lại tỷ lệ phát triển phôi bào cao hơn so với phương pháp ion Ca²⁺. Do đó, PLCζ từ lâu được xem là một phương pháp thay thế nội sinh sinh lý để điều trị lâm sàng các trường hợp thất bại hoạt hóa noãn. Ngoài ra, việc sản xuất in vitro các thể tinh khiết của protein PLCζ tái tổ hợp, nhằm loại bỏ bất kỳ tác dụng gây độc tế bào tiềm ẩn nào trong quá trình phát triển phôi và xác nhận tính an toàn tổng thể của PLCζ ngoại sinh trên thế hệ con sau này vẫn đang được thực hiện.

Tóm lại, PLCζ không chỉ đại diện cho một tác nhân điều trị lâm sàng đầy hứa hẹn mà còn là một dấu ấn sinh học chẩn đoán mạnh mẽ tiềm năng phát triển của phôi. Ngoài ra, chúng có thể giúp xác định các tiêu chí và yêu cầu khi điều trị hỗ trợ sinh sản ở bệnh nhân nam, làm giảm đáng kể số chu kỳ thực hiện để mang lại kết quả điều trị thành công cho bệnh nhân.

Lược dịch từ: Saleh A, Kashir J, Thanassoulas A, Safieh-Garabedian B, Lai FA and Nomikos M. Essential Role of Sperm-Specific PLC-Zeta in Egg Activation and Male Factor Infertility: An Update. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 28.

Từ khóa: PLCζ, hoạt hóa noãn, vô sinh nam.