CNSH Cái Thị Diệu Ánh – IVF Vạn Hạnh


Chuẩn bị tinh trùng là một khâu quan trọng và không thể xem thường trong công nghệ hỗ trợ sinh sản (assisted reproductive technology – ART), vì thành công của một quy trình ART cụ thể phụ thuộc vào chất lượng tinh trùng sử dụng. Do đó, hầu hết các quy trình ART (IUI, IVF, ICSI) đều yêu cầu chuẩn bị tinh trùng từ tinh dịch, nhằm phân lập tinh trùng bình thường và di động tốt ra khỏi lớp tinh dịch.
 
Có rất nhiều phương pháp chuẩn bị tinh trùng, cơ bản phổ biến như phương pháp rửa đơn thuần, bơi lên trực tiếp (Swim-up/SU) hay thang nồng độ không liên tục (DG). Tuy nhiên các phương pháp này vẫn còn một số hạn chế cần cải thiện như quá trình ly tâm tạo ra ROS cao hoặc có thể gây bất lợi về tính toàn vẹn DNA tinh trùng, hay hiệu quả phân lập được tinh trùng có chất lượng tốt nhất. Ngoài ra, một số phương pháp khác sử dụng như phân lập tinh trùng bằng từ tính (MACS) được thực hiện dựa trên nguyên lý của quá trình apoptosis ở tế bào. Tinh trùng apoptosis sẽ liên kết với vi hạt từ tính, đi qua cột lọc có từ trường sẽ giữ lại và loại bỏ, chỉ thu lại tinh trùng bình thường. Mặc dù khả năng thu hồi tinh trùng di động cao, nhưng hạn chế về tính hiệu quả và an toàn đặc biệt là trên đối tượng bệnh IUI, đồng thời các bước thao tác tốn thời gian thực hiện (≈1 giờ).
 
Để khắc phục hạn chế của các phương pháp chuẩn bị tinh trùng thông thường, các thiết bị vi dòng chảy (MSS) khác nhau đã được giới thiệu. Phương pháp này không cần ly tâm nên không tạo ROS hay gây phân mảnh DNA tinh trùng, cũng như tiết kiệm thời gian xử lý tinh trùng, tăng độ sạch và tỷ lệ di động sau lọc rửa. Tuy vậy, nhiều loại MSS này có cổng nạp dung tích thấp, chỉ cho phép xử lý từ vài μL đến dưới 500 μL, trong khi số lượng tinh trùng có thể được xử lý phụ thuộc vào điều kiện pha loãng cần thiết cho hoạt động của từng MSS. Nhằm hạn chế nhược điểm này, thiết bị vi dòng chảy quán tính theo hình xoắn ốc gần đây được ứng dụng để phân lập tinh trùng và chứng minh thành công loại bỏ bạch cầu với lưu lượng và thu hồi tinh trùng cao hơn so với các phương pháp thông thường.
 
Bài viết này đề xuất đánh giá thử nghiệm hiệu suất một thiết bị mới hoàn toàn tự động sử dụng vi dòng chảy quán tính theo hình xoắn ốc đôi đa chiều (multi-dimensional double spiral – MDDS) được chứng minh phân lập tinh trùng thành công ra khỏi các tế bào lạ khác (bạch cầu, tế bào biểu mô, hồng cầu,…) trong mẫu tinh dịch với tỉ lệ thu hồi cao (>96%) và khảo sát nguyên lý hoạt động của thiết bị này.
 
Thiết kế thí nghiệm:

• TN1: khảo sát hoạt động của tinh trùng và bạch cầu được phân tách theo quỹ đạo trong thiết bị MDDS. Tinh trùng sau khi lọc rửa, được nhuộm DAPI và bạch cầu đánh dấu marker để phân biệt quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang trong các điều kiện dòng chảy khác nhau, và mức độ thu hồi được đếm tại đầu ra thông qua phương pháp đo dòng chảy tế bào.
• TN2: tinh dịch thô (chưa lọc rửa) thử nghiệm với nhiều độ nhớt khác nhau và quan sát quỹ đạo một cách gián tiếp thông qua TN1. Đánh giá tỉ lệ thu hồi thông qua đo dòng chảy tế bào và sử dụng CASA đánh giá di động tinh trùng.

 
Kết quả thu được:

• Thiết bị MDDS cấu tạo đặc biệt với 2 kênh xoắn ốc. Kênh 1 thiết kế kênh tương đối nhỏ so với kênh xoắn ốc 2, mục đích tạo lực nâng quán tính mạnh hơn để gom mẫu tập trung vào bên trong kênh. Tuy nhiên, lực nâng không đủ mạnh với các hạt/tế bào nhỏ hơn kích thước cụ thể nên kết quả không tập trung hay tập trung ở  phần giữa kênh thay vì tập trung ở phía thành bên trong. Trong kênh xoắn ốc thứ 2, kích thước kênh tăng nên lực nâng tác động lên các hạt/tế bào giảm, và các hạt/tế bào chuyển đến vị trí cân bằng (xác định giữa lực nâng quán tính và lực cản Dean) dẫn đến phân tách theo kích thước. Ngoài ra, thiết kế kênh xoắn ốc 2 có mặt cắt hình thang tạo xoáy Dean mạnh hơn ở nửa ngoài kênh, dẫn đến đẩy các hạt/tế bào nhỏ ra thành bên ngoài hiệu quả hơn, không gây ảnh hưởng đến vị trí tập trung các hạt/tế bào lớn gần thành trong.
• Với tốc độ dòng chảy 2,0 mL/phút, khả năng thu hồi tinh trùng là > 90%, trong khi tỷ lệ loại bỏ các hạt 10 μm (đại diện ≈ kích thước bạch cầu) là > 98%. Trong trường hợp các mảnh vụn khác, được xác định là một quần thể riêng biệt có kích thước/mật độ thấp hơn so với tinh trùng phân tích khi đo bằng thiết bị đo dòng chảy tế bào (≈40% thu hồi).
• Đối với mẫu tinh dịch có độ nhớt cao, MDDS được thiết kế đặc biệt tạo các kênh xoắn ốc cùng với van một chiều làm tuần hoàn lại mẫu tinh dịch nhiều lần để loại bỏ thành phần gây nhớt. Với mỗi chu kỳ tuần hoàn - phân tách, tinh trùng ở đầu ra ≈ 3 mL được cô đặc gần gấp mười lần so với mẫu đầu vào là 50 mL trong vòng 15 phút từ 4 chu kỳ tuần hoàn bởi MDDS bốn kênh (1 × MDDS). Nếu thử nghiệm trên 2 x MDDS tức 8 kênh xoắn ốc, chúng hoạt động nhanh hơn và giảm chu kỳ tuần hoàn (do tăng khối lượng tinh trùng chết) nên nền tảng 2 x MDDS khả năng lọc thấp hơn và giảm yếu tố thu gom tinh trùng (≈5 lần), mặc dù thời gian xử lý mẫu giảm xuống <8,5 phút, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp thông thường (≈ 1 giờ).

 
Tóm lại:
MDDS được sử dụng trong chuẩn bị tinh trùng, ứng dụng tập trung vào IUI nhằm thay thế các phương pháp chuẩn bị tinh dịch thông thường có khả năng thu hồi tinh trùng thấp và hạn chế khi hoạt động. Hiệu suất phân tách tốt với tỉ lệ thu hồi ≈ 80% tinh trùng, đặc biệt loại bỏ 98 - 99,95% các hạt 10μm (đại diện cho bạch cầu) tương ứng từ mẫu có độ nhớt cao đến mẫu có độ nhớt thấp, tăng gấp 10 lần cô đặc tinh trùng so với lượng thể tích đầu vào.
 
Ngoài ra MDDS còn cung cấp các ưu điểm chính: (1) tự động hoàn toàn và tiết kiệm thời gian (≈10 phút cho 50mL mẫu tinh dịch pha loãng) không yêu cầu bước rửa trước nào, (2) phân tách dòng chảy liên tục (thu nhận đầu ra dễ dàng), (3) tối thiểu gây tổn hại tế bào, (4) xử lý mẫu với thể tích lớn (>1mL mẫu tinh dịch thô), (5) di động và kết cấu nhỏ gọn.
 
Thiết bị mới này có thể là một công cụ hiệu quả và tự động phân tách mẫu tinh dịch thô bằng việc tuần hoàn – phân tách, làm sạch trực tiếp phục vụ cho ART như là một giải pháp thay thế các phương pháp truyền thống vốn có những hạn chế cần cải thiện. Tuy nhiên, cần thêm những nghiên cứu ứng dụng sâu hơn với dụng cụ này để tìm ra điểm giới hạn của các thông số tinh trùng cho các trường hợp đặc biệt cũng như hiệu suất thực tế liên quan tới các yếu tố như tỉ lệ beta, thai lâm sàng,… hay đánh giá so sánh cụ thể giữa các phương pháp chuẩn bị tinh trùng khác.
 
Nguồn tham khảo: Jeon, H., Cremers, C., Le, D. et al. Multi-dimensional-double-spiral (MDDS) inertial microfluidic platform for sperm isolation directly from the raw semen sample. Sci Rep 12, 4212 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-08042-1

Từ khóa: Lọc rửa tinh trùng trực tiếp từ tinh dịch (không ly tâm) nhờ thiết bị vi dòng chảy theo xoắn ốc (MDDS)