ThS.BS.Đặng Quang Vinh

A.R.T. Consulting

IVF Vạn Hạnh

Hyaluronic acid hay còn gọi là hyaluronan, là một hoạt chất hiện diện ở rất nhiều loại mô trong cơ thể như các tổ chức da, biểu bì, khớp, mắt… HA còn là một thành phần quan trọng trong các dịch tiết của đường sinh dục. Đây là một hợp chất thuộc nhóm glycosaminoglycans, và có nhiều đặc tính giúp ích cho quá trình kết dính cũng như quá trình lành sẹo của vết thương. Trong thời gian qua, nhiều nghiên cứu cho thấy HA có thể giữ một vai trò trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.

Sàng lọc tinh trùng trưởng thành

Tinh dịch đồ hiện nay vẫn được xem là một xét nghiệm đầu tay để khảo sát hoạt động sinh sản của nam giới. Tuy nhiên, đa số các trị số của tinh dịch đồ không có giá trị cao trong việc chẩn đoán hay tiên lượng khả năng sinh sản của người nam trong môi trường in vivo hay in vitro. Việc chẩn đoán vô sinh ở nam giới chỉ được khẳng định khi mẫu xuất tinh liên tục không có tinh trùng hay tinh trùng bất động hoàn toàn. Tuy nhiên, những tình huống như vậy thường hiếm gặp trong thực tế lâm sàng. Ngoài ra, có khoảng 1/3 trường hợp có tinh dịch đồ bình thường, và được chẩn đoán là vô sinh chưa rõ nguyên nhân, và với những trường hợp này, việc lựa chọn một kỹ thuật hỗ trợ sinh sản hiệu quả nhất với chi phí thấp nhất và ít xâm lấn là một khó khăn hiện nay.

Tinh dịch đồ thường có giá trị tiên lượng thấp do chỉ khảo sát các yếu tố như số lượng, di động và hình dạng, mà không đề cập đến các hoạt động chức năng như nuclear maturity, cấu trúc ADN, khả năng gắn kết của tinh trùng vào trứng (Liu and Baker, 1992b; Cayli et al., 2003, 2004;  Huszar et al., 2003). Do đó, một số xét nghiệm đã được thực hiện thêm nhằm khảo sát các chức năng của tinh trùng như xét nghiệm gắn kết tinh trùng-màng trong suốt, phản ứng kích hoạt cực đầu… Tuy nhiên hầu hết các thử nghiệm này đều tốn thời gian, cần những trang thiết bị đắt tiền và nhất là các mẫu vật cho xét nghiệm thường bị hạn chế.

Nhiều chứng cứ cho thấy các thụ thể với HA chỉ xuất hiện ở những tinh trùng đã qua giai đoạn trưởng thành thông qua quá trình sắp xếp lại cấu trúc của màng tế bào tinh trùng, và do đó, chỉ những tinh trùng trưởng thành mới có khả năng gắn kết chặt với HA. Cho đến hiện nay, thử nghiệm gắn kết của tinh trùng vào màng trong suốt vẫn được xem là một xét nghiệm giúp sàng lọc các tinh trùng trưởng thành, có khả năng thụ tinh cao và có thể giúp tiên lượng khả năng thành công của IVF cổ điển (Silverberg and Turner, 2009). Khả năng chọn lọc tinh trùng của HA đã được chứng minh là tương đương với màng trong suốt (Huszar et al, 2007; Prinosilova, 2009).

Một số chỉ số sinh học (biomarker) đã được sử dụng để tiên đoán khả năng thụ tinh của tinh trùng, hoàn toàn độc lập với các giá trị của tinh dịch đồ, trong đó, đáng chú ý là creatinine kinase (CK). Người ta ghi nhận nồng độ CK trong tinh trùng những người thuộc nhóm vô sinh thường cao hơn hẳn so với nhóm đã từng có con (Huszar, 2007). Gia tăng nồng độ CK được cho là hậu quả của tăng lượng protein có trong bào tương, một biểu hiện của sự bất thường trong quá trình trưởng thành của tinh trùng.

Có mối tương quan giữa nồng độ CK trong tinh trùng với chỉ số gắn kết HA trong mẫu tinh dịch. Trong một khảo sát trên 56 bệnh nhân, được chia làm 3 nhóm, nhóm 1 gồm những bệnh nhân có chỉ số gắn kết ≥ 80%, nhóm 2 có chỉ số gắn kết trong khoảng 60 – 80% và nhóm 3 có chỉ số gắn kết ≤ 60%. Nồng độ CK trung bình ở ba nhóm lần lượt là 0,18 ± 0,02 CKIU/10⁸ tinh trùng, 0,5 ± 0,06 CK IU/10⁸ tinh trùng và 2,8 ± 0,1 CK IU/10⁸ tinh trùng (giá trị bình thường là < 0,25). Ngoài ra, mối liên quan giữa chỉ số CK và kết quả thành công của IUI và IVF (Huszar et al, 1992; Ergur et al, 2002).

Dựa trên các khảo sát này, các tác giả đề nghị chỉ số gắn kết HA của tinh trùng có thể được sử dụng để tiên lượng khả năng thành công của kỹ thuật điều trị. Nếu chỉ số gắn kết ≤ 60%, ICSI nên được thực hiện, ≥ 80% có thể tiến hành IUI và trong khoảng 60-80%, có thể tiến hành IVF (Huszar, 2007). Do đó, tác giả đề nghị thực hiện HBA như một test sàng lọc để góp phần lựa chọn phương án điều trị cho những trường hợp vô sinh chưa rõ nguyên nhân. Trong khảo sát khả năng gắn kết với HA (Hyaluronan Binding Assay-HBA), sự gắn kết với HA của tinh trùng xảy ra ổn định trong khoảng thời gian từ 8-10 phút. Vị trí gắn kết xảy ra ở phần đầu của tinh trùng. Chỉ những tinh trùng nào gắn kết chặt với HA thì mới có đạt độ trưởng thành cao, không còn giọt bào tương, có cấu trúc thể cực đầu toàn vẹn.

Lựa chọn tinh trùng trong ICSI

Trong môi trường in vivo hay với thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển (IVF), tinh trùng phải trải qua một số phản ứng thay đổi về cấu trúc cũng như khả năng di động như phản ứng hoạt hóa (capacitation), phản ứng cực đầu (acrosome reaction) và tăng động (hyperactivation). Tinh trùng sẽ phải đi xuyên qua lớp tế bào quanh trứng (cumulus và corona radiata cells) để bám vào màng trong suốt (zona pellucida-ZP). Từ đây, chỉ một tinh trùng duy nhất có thể xuyên qua màng bào tương của trứng để thụ tinh có thể xảy ra. Do đó, trong thụ tinh bình thường, có hai hiện tượng chọn lọc xảy ra để đảm bảo chỉ những tinh trùng bình thường và có khả năng thụ tinh cao nhất mới vào được bào tương trứng để hoàn tất quá trình thụ tinh. Hai rào cản đó chính là lớp tế bào quanh noãn và màng trong suốt. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy chỉ những tinh trùng đã hoàn toàn trưởng thành mới có thể xuyên qua lớp tế bào quanh noãn này, và có mối liên hệ mật thiết giữa chỉ số gắn kết tinh trùng: zona pellucida (sperm-zona binding assay) và tỷ lệ thụ tinh trong in vitro (Prinosilova et al, 2008).

Về mặt kỹ thuật, ICSI được xem là một kỹ thuật mang tính “xâm lấn”, khi một tinh trùng được đưa trực tiếp vào bào tương trứng đã trưởng thành, mà không trải qua các giai đoạn của thụ tinh tự nhiên. Trước khi tiến hành tiêm tinh trùng, các tế bào quanh trứng sẽ được tách bỏ và với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao tác, một tinh trùng sẽ được tiêm trực tiếp vào bào tương trứng. Như vậy, các “hàng rào” sinh học tự nhiên đã hoàn toàn bị vượt qua. Do đó, trong ICSI, việc lựa chọn tinh trùng để đưa vào sử dụng đóng vai trò rất quan trọng. Hiện nay, công đoạn này chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người thực hiện, thông qua việc quan sát đánh giá hình dạng và di động của tinh trùng dưới kính hiển vi.

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy hình dạng bình thường tinh trùng, nếu được đánh giá bằng tiêu chuẩn nghiêm ngặt, không liên quan với tỷ lệ thành công của ICSI (French et al, 2010). Ngoài ra, việc lựa chọn tinh trùng có hình dạng “bình thường” trong quá trình ICSI vẫn có thể không ảnh hưởng đến kết quả có thai, dù với những mẫu tinh trùng dị dạng nặng. Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x400, khó có thể tiên đoán tinh trùng đó có bình thường về cấu trúc di truyền hay không, bao gồm bất thường số lượng nhiễm sắc thể hay tổn thương ADN. Một điểm cần lưu ý chỉ định chính của ICSI là cho những trường hợp có bất thường tinh trùng nặng. Với những trường hợp này, bất thường về hình dạng thường đi kèm với bất thường về di truyền (Celik et al, 2004). Ngoài ra, Nars-Esfahani và cs cũng cho thấy có mối liên hệ giữa bất thường hình dạng tinh trùng và tỷ lệ ADN phân mảnh (r = 0,36 với p = 0,008). Như vậy, những tinh trùng có thể sẽ không được lựa chọn trong tự nhiên lại được thụ tinh với trứng thông qua kỹ thuật vi thao tác.

Tinh trùng có bất thường về di truyền (lệch bội, ADN phân mảnh) nếu được thụ tinh với trứng có thể gây ra một số nguy cơ. Mối liên hệ mật thiết giữa bất thường di truyền hay ADN phân mảnh (DNA fragmentation) với tỷ lệ sẩy thai đã được chứng minh qua một nghiên cứu tổng quan hệ thống (systematic review). Nghiên cứu này, tổng kết số liệu từ 11 bài báo cáo với 1549 chu kỳ TTTON, cho thấy phân mảnh DNA có tương quan có ý nghĩa thống kê với tỷ lệ sẩy thai (OR là 2,48; với khoảng tin cậy 95% là 1,52 – 4,04; p = 0,0001; Zini et al, 2008). Do đó, việc lựa chọn được tinh trùng trưởng thành, có khả năng thụ tinh cao và không bất thường về di truyền đóng vai trò quan trọng trong ICSI, nhất là trong các trường hợp số lượng trứng có hạn (Parmegiani et al, 2010).

Trong ICSI, Polyvinylpyrrolidone (PVP) hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích. Là một chất có nguồn gốc tổng hợp với độ nhớt cao, PVP giúp giảm khả năng di động của tinh trùng để dễ dàng thao tác. Ngoài ra, độ nhớt cao cũng giúp PVP có thể được sử dụng như một tác nhân tạo áp lực trong kim tiêm tinh trùng được ổn định. Tuy nhiên, PVP chỉ đơn thuần là một chất làm giảm độ di động của tinh trùng, mà không có khả năng lựa chọn tinh trùng không bị bất thường về di truyền hay tổn thương cấu trúc ADN. Parmegiani et al, vào năm 2010 đã cho thấy tỷ lệ tinh trùng bị phân mảnh sau khi tiếp xúc PVP không khác biệt so với mẫu tinh trùng sau chuẩn bị. Kết quả này một lần nữa khẳng định PVP hoàn toàn không có khả năng phân loại tinh trùng bình thường/bất thường về di truyền (Parmegiani et al, 2010).

Bên cạnh đó, tính an toàn của PVP cũng đang được bàn cãi. Do có nguồn gốc tổng hợp, PVP không có tính hòa tan và không thể được “tiêu hóa” bằng cơ chế thực bào, do đó, sau khi tiêm vào bào tương trứng, PVP có thể tồn tại trong trứng một thời gian dài. Mặc dù ảnh hưởng của PVP lên trứng chưa được nghiên cứu kỹ, nhưng tinh trùng sau khi tiếp xúc PVP trong thời gian lâu bị thay đổi trong siêu cấu trúc. Do đó, một số tác giả cho rằng triển khai những phương thức thay thế hay loại bỏ PVP trong ICSI là điều cần thiết (Jean et al, 2001; Picton et al, 2005).

Hyaluronic acid (HA) là một chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên. Đây là một loại enzyme có trong lớp tế bào bao quanh trứng. Nhiều nghiên cứu cho thấy HA có khả năng chọn lọc những tinh trùng không bị tổn thương ADN (Huszar et al, 2007; Nasr-Esfahani et al, 2008). Trong một nghiên cứu báo cáo năm 2010, Parmegiani và cs đã cho thấy tinh trùng gắn kết vào HA có tỷ lệ phân mảnh DNA thấp và có cấu trúc nhân bình thường so với tinh trùng trong PVP (Parmegiani et al, 2010). Kết quả cũng cho thấy khi sử dụng những tinh trùng gắn kết HA để tiêm vào bào tương trứng trong ICSI có thể gia tăng tỷ lệ phôi có chất lượng tốt, tăng tỷ lệ thai lâm sàng và giảm tỷ lệ sẩy thai. Một nghiên cứu bệnh chứng (case control) báo cáo năm 2007 (Anderson et al, 2007) cho thấy sử dụng tinh trùng gắn kết HA cho tỷ lệ thụ tinh cao hơn nhóm chứng (p=0,001). Nhóm có gắn kết HA cũng cho tỷ lệ phôi tốt cao hơn, tỷ lệ thai lâm sàng cao hơn trong khi giảm tỷ lệ sẩy thai.

Trong khi đó, kết quả một báo cáo loạt ca cho thấy có mối tương quan nghịch giữa tỷ lệ gắn kết HA với thiếu hụt protamine và phân mảnh ADN với hình dạng bất thường của tinh trùng (p<0,05). Ngoài ra, tỷ lệ thụ tinh trong nhóm sử dụng tinh trùng gắn kết AH cao hơn (p< 0,05), trong khi tỷ lệ thai lâm sàng và làm tổ của phôi tăng nhưng không có ý nghĩa thống kê (Nasr-Esfahani et al, 2008).

Hiệu quả của việc lựa chọn tinh trùng bình thường với HA cũng được củng cố bởi kết quả nghiên cứu của Prinosilova năm 2009. Kết quả cho thấy sử dụng HA để lựa chọn tinh trùng trưởng thành, khả năng thụ tinh bình thường cao tương đương với sử dụng thử nghiệm gắn kết tinh trùng - màng trong suốt (hemi zona binding assay). Bên cạnh đó, tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường (tiêu chuẩn nghiêm ngặt) ở nhóm gắn kết HA cao hơn so với mẫu tinh dịch ban đầu (Prinosilova, 2009).

Cho đến nay, hiện chỉ có một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trên bệnh nhân để so sánh HA và PVP được báo cáo (Parmegiani et al, 2010). Trong nghiên cứu này, một lần nữa, hiệu quả của HA trong việc chọn lựa tinh trùng có tỷ lệ ADN phân mảnh thấp và hình dạng nhân bình thường được khẳng định (lần lượt là 11% so với 5,3%, p < 0,01 và 11% so với 14,5%, p = 0,013). Ngoài ra, kết quả ICSI trên 107 chu kỳ sử dụng PVP và 125 chu kỳ sử dụng HA cho thấy tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ thai và làm tổ có xu hướng tăng cao hơn, tuy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, nhóm HA có tỷ lệ phôi tốt cao hơn so với PVP (35,8% so với 24,1%, p=0,046). Đây được xem là một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng lớn nhất hiện nay về hiệu quả của HA.

Trong một nghiên cứu hồi cứu trên số lượng lớn hơn (331 chu kỳ ICSI sử dụng HA), khi so sánh với 97 chu kỳ ICSI dùng PVP, nhóm tác giả này cho thấy tỷ lệ phôi chất lượng tốt và tỷ lệ làm tổ ở nhóm sử dụng HA cao hơn so với PVP (lần lượt là 32,3% so với 21,6%, p=0,011 và 17,1% và 10,3%, p=0,047; Parmegiani et al, 2010b).

Hiện nay, có hai dạng chế phẩm có chứa HA trên thị trường, một là dĩa petri đã được phủ một lớp HA lên trên (PICSI Sperm Selection Device; MidAtlantic Diagnostic) và chế phẩm còn lại ở dạng môi trường có chứa HA (Sperm Slow; MediCult). Cả hai dạng chế phẩm đều đạt tiêu chuẩn chất lượng về an toàn và ổn định của châu Âu (CE). Riêng PICSI cũng vừa được Cục Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng trên người.

Môi trường chuyển phôi

Tỷ lệ thành công của các chu kỳ TTTON thường dao dộng trong khoảng 30-40%, chủ yếu là do khả năng làm tổ thấp của phôi. Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về các chất đánh dấu sinh học có tiềm năng (biomarkers) cho tính chấp nhận của NMTC (Giudice, 1999) nhưng cho đến nay, vẫn chưa có một nghiên cứu nào mang tính ứng dụng lâm sàng, và do đó, các phương thức để tăng khả năng làm tổ của phôi hiện vẫn mang tính “emperical”. Ngoài ra, nhiều ý kiến lo ngại về tình trạng phôi bị tống xuất ra khỏi buồng tử cung ngay sau khi chuyển phôi hay một thời gian sau đó (Mansour et al, 2002).

Với đặc tính là một phân tử ái nước cao, HA có thể hình thành một dạng hợp chất có tính kết dính cao, do đó, giúp cho sự liên kết các tế bào được dễ dàng và bền vững hơn. Bên cạnh đó, quan sát cho thấy độ xâm lấn của khối u biểu mô buồng trứng có liên quan mật thiết với nồng độ HA bên trong khối u (Anttila et al, 2000). Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy sự thay đổi của nồng độ HA trong tử cung chuột quanh thời điểm làm tổ của phôi (San Martin et al., 2003). Các dữ liệu trên cho thấy hyaluronic acid có thể đóng vai trò nào đó trong quá trình phôi kết dính và làm tổ vào niêm mạc tử cung cũng như sự phát triển của phôi sau khi được chuyển vào buồng tử cung. Giả thuyết này đã được chứng minh qua các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột (Gardner  and Lane, 2000) và sau đó là các báo cáo trên người (Schoolcraft et al., 2002; Simon et al., 2003; Balaban et al., 2004; Balaban and Urman, 2005).

Hiệu quả của việc bổ sung HA trong môi trường chuyển phôi cũng được khảo sát qua các nghiên cứu ngẫu nhiên lâm sàng, có nhóm chứng. Trong một nghiên cứu thực hiện trên 417 chu kỳ sử dụng chuyển phôi thông thường (chứa HSA) và 398 chu kỳ sử dụng môi trường chuyển phôi có bổ sung HA, tác giả kết luận tỷ lệ thai lâm sàng và tỷ lệ làm tổ ở nhóm HA cao hơn so với nhóm sử dụng HSA (33,6% so với 25,9% và 16% và 11%, p < 0,05). Sự khác biệt này xuất hiện ở nhóm bệnh nhân thất bại làm tổ hay có yếu tố tai vòi (Valojerdi et al., 2006). Kết quả này được khẳng định trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có nhóm chứng của Friedler và cs năm 2007. Nghiên cứu được thực hiện trên những bệnh nhân < 43 tuổi và 4 lần thất bại làm tổ với TTTON, kết quả cho thấy nhóm có sử HA trong môi trường chuyển phôi có tỷ lệ thai lâm sàng và tỷ lệ làm tổ cao hơn so với nhóm không được bổ sung HA (35,2% và 16,3% ở nhóm HA so với 10% và 4,8% ở nhóm không sử dụng HA, p < 0,005). Khả năng cải thiện tỷ lệ làm tổ ở những chu kỳ chuyển phôi chất lượng kém của HA cũng được Urman và cs báo cáo trong một nghiên cứu RCT vào năm 2008.

Ngoài ra, khi khảo sát ở những nhóm bệnh nhân không “lựa chọn”, mặc dù không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ thai và tỷ lệ làm tổ, tuy nhiên các tác giả khác ghi nhận tỷ lệ đa thai cao hơn ở nhóm có bổ sung HA trong môi trường chuyển phôi, dù số phôi chuyển ở hai nhóm là tương đương. Bên cạnh đó, tỷ lệ trẻ sinh sống ở nhóm có bổ sung HA cũng cao hơn so với nhóm không bổ sung (74,5% so với 62,5%, p < 0,05, Simon et al, 2003).

Tuy nhiên, hiện nay, đa số các tác giả đều cho rằng vẫn chưa xác định được hiệu quả tích cực của HA trong môi trường chuyển phôi là kết quả của sự cải thiện khả năng tiếp nhận của niêm mạc tử cung hay do tăng khả năng làm tổ của phôi.

Tài liệu tham khảo

Anttila  MA,  Tammi  RH,  Tammi  MI,  et al. High levels of stromal hyaluronan predict poor disease outcome in epithelial ovarian cancer. Cancer Res 2000;60:150 –5

Balaban  B,  Urman  B.  Comparison  of  two  sequential  media  for  culturing cleavage  stage  embryos and blastocysts: embryo characteristics and clinical outcome. RBM Online 2005;10:485–491

Balaban B, Isiklar A, Yakin K, Gursoy H, Urman B: Increased implantation rates in patients with recurrent implantation failures following the use a new transfer medium enriched with hyaluronan. Hum Reprod Suppl 2004;19:7

Celik-Ozenci C, Jakab A, Kovacs T, et al. Sperm selection for ICSI: shape properties do not predict the absence of numerical chromosomal aberration. Hum Reprod 2004;19:1052-9

Ergur AR, Dokras A, Juan L et al. Sperm maturity and treatment choice of in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection: diminished sperm HspA2 chaperone levels predict IVF failure. Fertil Steril, 2002;77:910

French B, Sabanegh E, Goldfarb et al. Does severe teratozoospermia affect blastocyst formation, live birth rate, and other clinical outcome parameters in ICSI cycles? Fertil Steril,2010;93:1097–103

Friedler S, Schachter M, Strassburger D et al. A randomized clinical trial comparing recombinant hyaluronan/recombinant albumin versus human tubal fluid for cleavage stage embryo transfer in patients with multiple IVF-embryo transfer failure. Human Reproduction Vol.22, No.9 pp. 2444–2448, 2007

Gardner DK, Lane M. Recombinant human serum albumin and hyaluronan  can  replace  blood-derived  albumin  in  embryo  culture  media [abstr]. Fertil Steril 2000;74(Suppl):S31–2

Huszar G, Jakab A, Sakkas D et al. Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspects. Reprod Biomed Online. 2007;14:650–63.

Jean M, Mirallie S, Boudineau M et al. Intracytoplasmic sperm injection with polyvinylpyrrolidone: a potential risk. Fertil Steril 2001;76:419-20

Mansour  RT,  Aboulghar  MA.  Optimizing  the  embryo  transfer  technique. Hum Reprod 2002;17:1149 –53

Nasr-Esfahani MH, Razavi S, Vahdati AA, et al. Evaluation of sperm selection procedure based on hyaluronic acid binding ability on ICSI outcome. J Assist Reprod Genet 2008;25:197–203

Parmegiani L, Cognigni G, Bernardi S et al. ‘‘Physiologic ICSI’’: Hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. Fertil Steril; 2010a;93:598–604.

Parmegiani L, Cognigni G, Ciampaglia W et al. Efficiency of hyaluronic acid (HA) sperm selection. J Assist Reprod Genet 2010b, in press

Picton HM, Opsahl MS, Lincoln SR et al. Conventional ICSI with limited or no use of PVP. Fertil Steril,2005:84,Suppl1.

Prinosilova P. Selectivity of hyaluronic acid binding for spermatozoa with normal Tygerberg strict Morphology. Reprod Biomed Online 2009;18:177-183

San  Martin  S,  Soto-Suazo  M,  Zorn  TMT.  Distribution  of  versican  and hyaluronan in the mouse uterus during decidualization. Braz J Med Biol Res 2003;36:1067–1071

Schoolcraft W, Lane M, Stevens J, Gardner DK: Increased hyaluronan concentration in the embryo transfer medium results in a significant increase in human embryo implantation rate. Fertil Steril 2002;76(Suppl 3):S5

Simon  A,  Safran  A,  Revel  A. Hyaluronic  acid  can successfully  replace  albumin  as  the  sole  macromolecule  in a  human  embryo  transfer  medium.  Fertil  Steril  2003;79: 1434–143

Urman B, Yakin K, Ata B, Isiklar A, Balaban B. Effect of hyaluronan-enriched transfer medium on implantation and pregnancy rates after day 3 and day 5 embryo transfers: a prospective randomized study. Fertil Steril. 2008 Sep;90(3):604-12.

Valojerdi M, Karimian L, Yazdi P et al. Efficacy of a human embryo transfer medium: a prospective, randomized clinical trial study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, No. 5, May 2006

Worrilow  KC,  Huynh  T,  Bower  JB,  et al. PICSI vs ICSI: statistically significant improvement in clinical outcomes  in  240  in  vitro  fertilization  (IVF)  patients.  Fertil Steril 2007;88(Supp 1):s37.

Zini A, Boman J, Belzil E and Ciampi A. Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis. Hum Reprod, 2008;23:2663–2668.