Nội dung chính

Trong lĩnh vực công nghệ hỗ trợ sinh sản (HTSS), chuyển phôi nang đông lạnh hiện đang trở thành một chiến lược chuẩn hóa tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) trên toàn thế giới[1]. Sự dịch chuyển từ chuyển phôi tươi sang chiến lược đông lạnh toàn bộ (freeze-all) kết hợp với chuyển đơn phôi (single-embryo transfer - SET) giúp hạn chế ảnh hưởng tiêu cực của tình trạng quá kích buồng trứng, thiết lập sự đồng bộ tối ưu giữa tuổi phôi và khả năng tiếp nhận của nội mạc tử cung. Bên cạnh đó, phương pháp này giảm thiểu tối đa nguy cơ mắc hội chứng quá kích buồng trứng (Ovarian Hyperstimulation Syndrome – OHSS)[2]. Ngoài ra, đông lạnh phôi nang là bước bắt buộc trong quy trình thực hiện xét nghiệm di truyền bất thường số lượng nhiễm sắc thể (NST) của phôi (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy - PGT-A) nhằm lựa chọn phôi nguyên bội trước khi chuyển cho bệnh nhân[1].

Trong quy trình bảo quản lạnh, kỹ thuật thủy tinh hóa (vitrification) đã hoàn toàn thay thế phương pháp đông lạnh chậm (slow freezing) truyền thống[1]. Thủy tinh hóa là quá trình hóa rắn vật lý của dung dịch mà không có sự hình thành cấu trúc tinh thể đá, đưa tế bào phôi vào trạng thái vô định hình giống thủy tinh[3]. Tỷ lệ sống của phôi nang sau rã hiện nay đạt mức rất cao, thường dao động trong khoảng 95% đến 99%[1].

Tuy nhiên, có khoảng 1% đến 5% phôi nang thủy tinh hóa thất bại trong việc phục hồi hoặc bị thoái hóa hoàn toàn sau rã đông[1]. Bên cạnh thoái hóa hoàn toàn, một tỷ lệ phôi nang còn trải qua hiện tượng thoái hóa một phần (partial degeneration) hoặc tổn thương tế bào ở các mức độ khác nhau sau rã[1]. Hiện tượng thoái hóa phôi nang sau rã bao gồm chết tế bào theo chương trình (apoptosis), hoại tử (necrosis) khối tế bào nội phôi (inner cell mass - ICM), lớp tế bào lá nuôi phôi (trophectoderm - TE) hoặc sự mất khả năng tái nở rộng khoang phôi (blastocoele re-expansion) làm giảm khả năng làm tổ, giảm tỷ lệ có thai lâm sàng và gia tăng nguy cơ sảy thai sớm[1].

Quá trình thủy tinh hóa và rã đông phôi nang đặt các tế bào phôi vào những điều kiện stress vật lý và hóa học[3]. Để ngăn ngừa sự hình thành tinh thể đá nội bào, phương pháp thủy tinh hóa sử dụng nồng độ chất bảo quản lạnh (cryoprotectants - CPAs) rất cao[3]. Các chất CPA thẩm thấu phổ biến bao gồm Ethylene Glycol (EG) và Dimethyl Sulfoxide (DMSO), kết hợp với các chất CPA không thẩm thấu như sucrose hoặc trehalose để tạo áp suất thẩm thấu ngoại bào lớn[3].

Về mặt lý hóa, sự thoái hóa phôi nang sau rã đông gồm hai cơ chế tổn thương chính: tổn thương cơ học do tinh thể đá (ice crystal damage) và độc tính hóa học của CPA (cryoprotectant toxicity)[3]. Do phôi nang có kích thước lớn và khoang phôi có thể tích nước đáng kể, cấu trúc này trở nên nhạy cảm hơn nhiều so với phôi giai đoạn phân chia[1]. Nếu tốc độ làm lạnh hoặc rã đông không đủ nhanh (yêu cầu tốc độ hạ nhiệt > 20.000°C/phút), hoặc nếu sự phân bố của các chất CPA vào sâu bên trong khối tế bào không đồng đều, hiện tượng tái kết tinh đá sẽ xảy ra trong khi rã[3]. Các tinh thể đá hình thành sẽ đâm rách màng sinh chất, phá hủy hệ thống lưới nội chất, ty thể và làm đứt gãy bộ khung xương actin-tubulin của tế bào phôi[4].

Bên cạnh đó, khi phôi nang tiếp xúc với môi trường rã đông chứa nồng độ sucrose giảm dần, sự khuếch tán của nước vào tế bào diễn ra với tốc độ nhanh hơn nhiều so với sự khuếch tán của CPA ra ngoài[3]. Điều này dẫn đến sự trương nở thể tích tế bào đột ngột, làm căng màng sinh chất[3]. Nếu tính toàn vẹn của màng tế bào hoặc hoạt động của các kênh vận chuyển nước bị suy giảm, tế bào sẽ bị vỡ hoàn toàn, biểu hiện trên lâm sàng là hiện tượng thoái hóa và hoại tử phôi[3]. Hơn nữa, nồng độ cao của CPA có thể gây độc trực tiếp cho phôi bằng cách biến tính protein màng, làm rối loạn cân bằng ion nội bào và kích hoạt các con đường truyền tín hiệu gây apoptosis thông qua sự giải phóng cytochrome C từ ty thể bị tổn thương[3].

Sự phục hồi hoàn toàn của phôi nang sau rã đông phụ thuộc trực tiếp vào động học tái nở rộng của khoang phôi nang (post-thaw re-expansion)[1]. Đây là một hoạt động sinh lý chủ động tiêu tốn năng lượng của phôi nang, đòi hỏi sự phối hợp nhịp nhàng của các hệ thống kênh ion và protein màng[4].

Sự hình thành và duy trì khoang phôi nang được điều hòa chủ yếu bởi bơm Na+/K+/ATPase, một protein xuyên màng dị hợp tử (heterodimeric transmembrane protein) khu trú tại màng bên - đáy (basolateral membrane) của các tế bào TE[5]. Bơm ion này sử dụng năng lượng từ quá trình thủy phân ATP để vận chuyển tích cực 3 ion Na+ từ nội bào vào khoang phôi nang, đổi lấy 2 ion K+ đi vào trong tế bào[5]. Hoạt động này thiết lập một gradient nồng độ Na+ cao bên trong khoang phôi nang, tạo ra một áp suất thẩm thấu lớn xuyên qua lớp biểu mô TE[5].

Các phân tích sinh học phân tử ở phôi người đã xác nhận sự biểu hiện mạnh mẽ của các tiểu đơn vị bơm Na+/K+/ATPase là alpha-1, beta-1 và beta-3[5]. Trong đó, tiểu đơn vị alpha-1 và beta-3 khu trú đặc hiệu tại màng bên - đáy của TE, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo động lực bơm thẩm thấu[5]. Dưới tác động của áp suất thẩm thấu do Na+ tạo ra, các phân tử nước được vận chuyển nhanh chóng vào khoang phôi thông qua các kênh dẫn nước chuyên biệt aquaporin phân bố trên màng tế bào TE[5].

Tuy nhiên, sự tích tụ dịch khoang phôi chỉ diễn ra thành công khi lớp biểu mô TE hình thành được một hàng rào thẩm thấu kín[5]. Hàng rào này được thiết lập bởi các phức hợp liên kết chặt (tight junctions) nằm ở phía ngọn (apical membrane) của các tế bào TE tiếp giáp nhau, bao gồm các protein liên kết trực tiếp với bộ khung xương actin của tế bào[5]. Nếu quá trình đông lạnh và rã đông gây tổn thương vi cấu trúc đến các liên kết chặt hoặc làm suy kiệt nguồn năng lượng ATP của tế bào, bơm Na+/K+/ATPase sẽ ngừng hoạt động, đồng thời dịch trong khoang phôi nang sẽ liên tục rò rỉ ngược ra ngoài qua các kẽ tế bào[4]. Hiện tượng này ảnh hưởng đến động học tái nở rộng khoang phôi, dẫn đến việc phôi bị thoái hóa hoặc co kéo dài, mất khả năng thoát màng và làm tổ[1].

Hệ thống phân loại chất lượng phôi nang dựa trên hình thái của Gardner và Schoolcraft là công cụ phổ biến nhất để đánh giá và tiên lượng tiềm năng phát triển của phôi[6]. Ba thành phần chính của hệ thống đánh giá này bao gồm: độ nở rộng khoang phôi, chất lượng ICM và chất lượng TE.

Độ nở rộng khoang phôi trước đông lạnh

Mức độ nở rộng của khoang phôi phản ánh thể tích dịch khoang phôi nang và trạng thái sinh lý của biểu mô TE[5]. Nghiên cứu của Ahlström và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng, độ nở rộng khoang phôi trước đông lạnh là một trong những yếu tố tiên lượng mạnh nhất cho khả năng sống và phát triển của phôi nang sau rã đông[7]. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ sinh sống tăng khoảng 36% cho mỗi cấp độ nở rộng của phôi nang trước khi đông lạnh (từ độ 2 đến độ 6) (P = 0,0061)[7].

Mặc dù các phôi nang có độ nở rộng cao thể hiện sức sống tốt, tuy nhiên thể tích dịch khoang phôi lớn ở phôi nang độ 4, 5, 6 làm cản trở sự thẩm thấu của CPA vào khối ICM bên trong do lượng nước lớn pha loãng nồng độ CPA nội bào[1]. Bên cạnh đó, tốc độ làm lạnh bị chậm do thể tích phôi lớn làm tăng đáng kể nguy cơ kết tinh đá nội bào và gây thoái hóa phôi sau rã đông[1].

Chất lượng TE

Nhiều nghiên cứu hiện đại đã chứng minh rằng chất lượng TE trước đông lạnh mới là yếu tố quyết định tỷ lệ sống sau rã đông, vượt trội hơn cả chất lượng ICM[6]. Lớp TE được phân loại thành Grade A, B và C[6]. Các phôi nang có lớp TE Grade A hoặc B có mật độ tế bào cao, các liên kết chặt và liên kết bám dính hoàn thiện, giúp lớp biểu mô có độ dẻo dai và tính đàn hồi tốt[6]. Khi đối mặt với sự co rút thể tích trong quá trình thủy tinh hóa và trương phồng thẩm thấu khi rã đông, màng biểu mô TE Grade A/B dễ dàng bảo toàn được tính toàn vẹn cấu trúc[6].

Ngược lại, phôi có TE xếp hạng C có số lượng tế bào quá ít và cấu trúc lỏng lẻo, dễ bị đứt gãy các liên kết tế bào dưới áp lực thẩm thấu[6]. Sự hư hại của các tế bào TE Grade C sau rã đông làm rò rỉ dịch khoang phôi, ngăn cản sự tái nở rộng và dẫn đến phôi thoái hoá[4]. Nghiên cứu định lượng của Ahlström và cộng sự (2013) cho thấy tỷ lệ trẻ sinh sống giảm 29% ở những phôi có lớp TE Grade B so với phôi xếp Grade A (P = 0,0099)[7].

Chất lượng ICM

Khối ICM đóng vai trò là nguồn gốc hình thành nên em bé[6]. Về mặt tiên lượng, một số nghiên cứu chỉ ra chất lượng ICM là yếu tố dự báo mạnh nhất cho tỷ lệ trẻ sinh sống sau khi chuyển phôi đơn[2]. Tuy nhiên, chất lượng ICM ít chịu ảnh hưởng hơn so với độ nở rộng của khoang phôi và chất lượng TE[6].

Khối ICM được bao bọc và bảo vệ bên trong khoang phôi nang bởi lớp TE, các tác động trực tiếp của sự thay đổi áp suất thẩm thấu và sự khuếch tán CPA sẽ ảnh hưởng đến lớp TE đầu tiên[4]. Nếu lớp TE bị thoái hóa hoàn toàn, cho dù khối ICM ban đầu có chất lượng tốt đến đâu phôi cũng không còn khả năng sống[4]. Do đó, tính toàn vẹn của TE là điều kiện cần để phôi vượt qua giai đoạn rã đông, trong khi chất lượng ICM là điều kiện đủ để đảm bảo sự phát triển bình thường của thai nhi sau khi làm tổ[6].

Thời gian phôi đạt đến giai đoạn phôi nang (Ngày 5, Ngày 6 hoặc Ngày 7 sau thụ tinh) là một dấu ấn động học quan trọng phản ánh năng lực sinh học và sức sống nội tại của phôi[8]. Sự khác biệt về động học phát triển có liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu thoái hóa của phôi nang trong quy trình đông lạnh-rã đông[8].

Phôi đạt giai đoạn phôi nang vào Ngày 5 đại diện cho nhóm phôi có tốc độ phân chia tối ưu, chu kỳ tế bào đồng bộ và bộ máy ty thể hoạt động hiệu quả nhất[8]. Các phân tích di truyền trong nghiên cứu của Whitney và cộng sự (2019) chứng minh phôi Ngày 5 có tỷ lệ nguyên bội (euploidy) cao nhất, trung bình đạt từ 53,5% đến 67,7%[8]. Về mặt cấu trúc, các phôi nang Ngày 5 có độ dày màng trong suốt đồng đều, sự phân cực và liên kết của lớp tế bào TE chắc chắn[6]. Do đó, tỷ lệ sống sau rã đông của phôi Ngày 5 đạt mức tối ưu, dao động từ 97,2% đến 98%[1]. Hoạt động của bơm ion Na+/K+/ATPase ở phôi Ngày 5 được tái kích hoạt nhanh chóng sau khi rã đông, cho phép phôi tái nở rộng khoang phôi nang với tốc độ nhanh nhất và giảm thiểu tối đa tỷ lệ thoái hóa tế bào[4].

Các phôi nang phát triển chậm đến Ngày 6 hoặc Ngày 7 thường mang những rối loạn chuyển hóa nội tại hoặc bất thường phân chia[8]. Tỷ lệ phôi nguyên bội giảm còn 40,4% ở phôi Ngày 6 và chỉ còn 35,9% ở phôi Ngày 7[8].

Sự suy giảm về tốc độ phát triển đi cùng với độ nhạy cảm của phôi đối với quá trình bảo quản lạnh[8]. Tỷ lệ sống sau rã giảm dần từ Ngày 5 sang Ngày 6 và giảm đáng kể ở Ngày 7[8]. Phôi Ngày 6 và Ngày 7 thường biểu hiện cấu trúc màng tế bào yếu hơn, mật độ tế bào TE thưa thớt, dễ bị tổn thương bởi hiện tượng sốc lạnh và stress oxy hóa trong quá trình thuỷ tinh hoá[8].

Nghiên cứu của Whitney (2019) cho thấy, mặc dù các phôi được chuyển đều là phôi nguyên bội, phôi Ngày 7 vẫn có tỷ lệ trẻ sinh sống thấp hơn đáng kể (43,8% so với 77,2% của phôi Ngày 5, P < 0,05) và tỷ lệ sảy thai cao gấp gần 10 lần (22,2% so với 2,6%, P < 0,05)[8]. Điều này chứng minh rằng sự phát triển chậm đến Ngày 7 phản ánh những tổn thương về mặt vi cấu trúc biểu mô và suy giảm hoạt động chức năng ty thể, làm tăng tính nhạy cảm của phôi đối với hiện tượng thoái hóa tế bào trong quy trình bảo quản lạnh[8]. Sau khi rã đông, phôi Ngày 7 có xu hướng giảm tế bào biểu mô diện rộng, tốc độ tái nở rộng chậm. Tuy nhiên, việc duy trì nuôi cấy đến Ngày 7 vẫn là một chiến lược lâm sàng có giá trị, giúp cứu vãn khoảng 6,6% tổng số phôi nang có thể sử dụng, mang lại cơ hội sinh con khỏe mạnh cho những bệnh nhân không có phôi Ngày 5/6[8].

Hiện tượng thoái hóa phôi nang sau rã là một quá trình sinh học phức tạp, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học của phôi nang trước khi thực hiện quy trình đông lạnh. Để tối ưu hóa tỷ lệ trẻ sinh sống và giảm thiểu tỷ lệ thoái hóa phôi nang sau rã đông, các trung tâm hỗ trợ sinh sản cần áp dụng các khuyến nghị thực hành lâm sàng chuẩn hóa và có chiến lược phù hợp.

[1] Allen M, Hale L, Lantsberg D, Kieu V, Stevens J, Stern C, et al. Post-warming embryo morphology is associated with live birth: a cohort study of single vitrified-warmed blastocyst transfer cycles. J Assist Reprod Genet. 2022;39(2):417-25.

[2] Ai J, Jin L, Zheng Y, Yang P, Huang B, Dong X. The Morphology of Inner Cell Mass Is the Strongest Predictor of Live Birth After a Frozen-Thawed Single Embryo Transfer. Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12:621221.

[3] Michailov Y, Friedler S, Saar-Ryss B. Methods to improve frozen-thawed blastocyst transfer outcomes- the IVF laboratory perspective. J IVF-Worldwide. 2023;1(1-3):1-15.

[4] Zhu J, Yin H, Wang C, Cao Z, Luan K, Wu Y, et al. The impact of completely shrunken blastocysts on clinical outcomes in vitrified-warmed single blastocyst transfer cycles. Sci Rep. 2025;15(1):31882.

[5] Hirakawa T, Goto M, Takahashi K, Iwasawa T, Fujishima A, Makino K, et al. Na+/K+ ATPase α1 and β3 subunits are localized to the basolateral membrane of trophectoderm cells in human blastocysts. Hum Reprod. 2022;37(7):1423-30.

[6] Bartolacci A, de Girolamo S, Solano Narduche L, Rabellotti E, De Santis L, Papaleo E, et al. Trophectoderm, Inner Cell Mass, and Expansion Status for Live Birth Prediction After Frozen Blastocyst Transfer: The Winner Is Trophectoderm. Life (Basel). 2024;14(11):1360.

[7] Ahlström A, Westin C, Wikland M, Hardarson T. Prediction of live birth in frozen-thawed single blastocyst transfer cycles by pre-freeze and post-thaw morphology. Hum Reprod. 2013;28(5):1199-209.

[8] Whitney JB, Balloch K, Anderson RE, Nugent N, Schiewe MC. Day 7 blastocyst euploidy supports routine implementation for cycles using preimplantation genetic testing. JBRA Assist Reprod. 2019;23(1):45-50.