CNSH. Dương Thị Ngọc Nữ, IVFMD Tân Bình – Bệnh viện Mỹ Đức
 
Giới thiệu:
Hiện nay, các phương pháp đánh giá khả năng làm tổ của phôi chủ yếu dựa trên đánh giá hình thái kết hợp dữ liệu động học phát triển phôi và hệ thống time-lapse. Bên cạnh đó, trong giai đoạn tiền làm tổ, tần suất xuất hiện các bất thường nhiễm sắc thể ở phôi người cao lên đến 75% ở phôi ngày 3 và 50% ở giai đoạn phôi nang, phần lớn dẫn đến thất bại làm tổ hoặc sảy thai sớm. Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ sàng lọc bất thường lệch bội NST (PGT-A) được ứng dụng giúp giảm tỷ lệ thất bại làm tổ và sảy thai, PGT-A đã được cải thiện qua các năm nhờ vào các tiến bộ trong công nghệ di truyền. Tuy nhiên, không phải tất cả các phôi nguyên bội có hình thái tốt đều có khả năng làm tổ và phát triển. Thực tế, chỉ khoảng 50% phôi nguyên bội làm tổ thành công. Điều này dẫn đến nhu cầu về các phương pháp toàn diện hơn dựa trên các chỉ dấu phân tử để phân tích thêm các đặc điểm di truyền của phôi, bao gồm bộ gene ty thể, di truyền biểu sinh và hệ phiên mã (transcriptomic) ở phôi tiền làm tổ. Nhiều nghiên cứu sử dụng công nghệ giải trình tự RNA-Seq để phát hiện các bất thường NST, nhưng chưa đánh giá tiềm năng của nó trong việc hỗ trợ lựa chọn phôi. Groff và cs (2019) đã xác định được bộ nhiễm sắc thể và một tập hợp gene liên quan đến khả năng phát triển của phôi, cho thấy rằng các phôi chất lượng thấp có thể bị mất kiểm soát phiên mã và biểu hiện gene không đúng cách, làm gián đoạn sự phát triển.
 
Liệu rằng có thể dự đoán bộ NST và xác định hồ sơ phiên mã phù hợp với sự phát triển kéo dài của phôi dựa trên dữ liệu giải trình tự RNA-Seq không? Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm so sánh kết quả phân tích NST thu được từ PGT-A so với phương pháp phân tích bộ NST (digital karyotype) từ dữ liệu RNA-Seq và hồ sơ phiên mã (transcriptomic profile) thông qua khả năng phát triển của phôi vào ngày thứ 11.
 
Phương pháp nghiên cứu:
Nghiên cứu thí điểm tiến cứu thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2023, phân tích tổng cộng 30 phôi nang trữ lạnh đã được thực hiện PGT-A  - NGS trước đó vào ngày 5 hoặc 6 (15 phôi nguyên bội và 15 phôi lệch bội). Các phôi được rã đông và thực hiện sinh thiết lần 2, sau đó từng phôi được nuôi cấy mở rộng đến ngày thứ 11 để đánh giá sự phát triển. Mẫu phôi sinh thiết lần 2 được giải trình tự RNA-Seq, xác định bộ NST bằng các đa hình đơn nucleotide biểu hiện (expressed single nucleotide polymorphisms - eSNP) và đánh giá sự biểu hiện gene khác biệt (differential expressed gene - DEG) giữa phôi không bám và phôi bám dính lên đĩa nuôi cấy. RNA tổng được tách chiết từ 30 mẫu phôi bằng bộ kit SMART-Seq v4 Ultra-Low Inpur RNA (Takara Bio, Mỹ), cDNA được tổng hợp và khuếch đại, sau đó xây dựng thư viện giải trình tự bằng bộ kit Nextera XT DNA Library Prep (Illumina, Mỹ) và giải trình tự trên hệ thống máy NovaSeq 6000 (Illumina). Dữ liệu thô được kiểm tra chất lượng bằng FastQC và được căn chỉnh với bộ gene tham chiếu GRCh 37 (hg19) bằng HISAT2. Có 9 mẫu bị loại khỏi nghiên cứu do dữ liệu tiền giải trình tự kém chất lượng hoặc không nhất quán.
 
Kết quả nghiên cứu:
Bộ NST thu được từ dữ liệu RNA-Seq có độ tương đồng cao so với dữ liệu PGT-A trước đó, với độ nhạy 0,81, độ đặc hiệu 0,83, chỉ số Cohen’s Kappa 0,66 và diện tích dưới đường cong ROC 0,9. Ở mức độ gene, 76 gene biểu hiện khác biệt (DEG) có ý nghĩa thống kê giữa phôi bám dính và không bám dính (Padj <0.05; FC > 1). Để giải thích các hệ quả chức năng của những sự khác biệt này, các con đường sinh học bị thay đổi có ý nghĩa được xác định dựa trên phân loại GO (Gene Ontology) và KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Màng trophectoderm (TE) của các phôi nang không bám dính cho thấy 63 gene tăng biểu hiện trong quá trình tự thực bào, apoptosis, hoạt động protein kinase và ubiquitin-like protein ligase; giảm biểu hiện của ribosome, spliceosome, kinetochore, phân tách và cô đặc nhiễm sắc thể. Phân tích hệ phiên mã cho thấy các phôi bám dính lên đĩa vào ngày 11 (với khả năng làm tổ lý thuyết cao hơn) bao gồm 501 gene, trong đó có: EMP2, AURKB, FOLR1, NOTCH3, LRP2, FZD5, MDH1, APOD, GPX8, COLEC12, HSPA1A, CMTM7, BEX3, có liên quan đến quá trình làm tổ và phát triển phôi (raw P-value < 0.05; shrunk LFC > 1,1). Các kết quả trên chỉ ra rằng sử dụng RNA-Seq và hồ sơ phiên mã có thể xác định phôi nguyên bội với tiềm năng làm tổ và phát triển cao hơn, đồng thời loại trừ phôi có bất thường NST.
 
Bàn luận:
Nghiên cứu này có các giới hạn bao gồm cỡ mẫu nhỏ, tỷ lệ khuếch đại RNA thành công thấp, không bao gồm bất thường cấu trúc NST và không thể chẩn đoán phôi khảm. Ngày tối đa cho sự phát triển in vitro là ngày 11 và việc bám dính vào đĩa không cung cấp dấu hiệu rõ ràng về khả năng làm tổ và khả năng sống của phôi. Ngoài những hạn chế này, kết quả của nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc thu thập hồ sơ biểu hiện gene của phôi có khả năng làm tổ cao. Đánh giá chính xác sự phát triển của phôi và khả năng làm tổ không chỉ cần thiết cho việc lựa chọn phôi mà còn giúp đưa ra quyết định tốt nhất về các phương pháp điều trị trong tương lai và tăng hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.
 
Kết luận:
Tính khả thi của việc triển khai trong thực hành lâm sàng kỹ thuật lựa chọn phôi chuyển mới dựa trên một phân tích duy nhất đánh giá cả về bộ NST và hồ sơ phiên mã của phôi có thể được xem xét trong tương lai. Sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ cho hệ phiên mã (PGT-T) có thể phát triển bằng cách phân tích dữ liệu giải trình tự RNA (RNA-Seq) để nghiên cứu khác biệt trong sự biểu hiện gene của phôi.
 
Nguồn: Ortega-Jaén D, Mora-Martinez C, Capalbo A, Mifsud A, Boluda-Navarro M, Mercader A, Martín Á, Pardiñas ML, Gil J, de Los Santos MJ. A pilot study of transcriptomic preimplantation genetic testing (PGT-T): towards a new step in embryo selection? Hum Reprod. 2024 Dec 24:deae265. doi: 10.1093/humrep/deae265. Epub ahead of print. PMID: 39719045.
 

Từ khóa: transcriptomic, RNA sequencing, PGT, lựa chọn phôi