Nguyễn Đình Tảo, Quản Hoàng Lâm,

Trịnh Thế Sơn  và cs

TÓM TẮT:

Các tế bào dòng tinh được phân lập bằng collagenase IV và được nuôi cấy trong môi trường Gamete được bổ sung FSH với nồng độ 50 IU l^-1 và testosterone với nồng độ 1mmol l^-1, ở nhiệt độ 32⁰C, nồng độ CO₂ 5%, trong thời gian 24 giờ.

Kết quả nghiên cứu cho thấy:

-    Collagenase IV có tác dụng tốt đối với quá trình phân lập các tế bào dòng tinh.

-    Số lượng tinh tử đang kéo dài, tinh tử đã kéo dài và tinh trùng tăng, trong khi đó số lượng tinh tử tròn giảm sau 24h nuôi cấy.

-    Tỷ lệ tinh trùng và tinh tử đã kéo dài di động tăng đáng kể sau nuôi cấy.

-    Có thể tạo được phôi với tinh trùng thu được sau nuôi cấy nhờ kỹ thuật vi tiêm.

SUMMARY:

STUDY ON IN-VITRO CULTURE OF SPERMATOGENIC CELLS WERE ISOLATED BY COLLAGENASE IV FROM AZOOSPERMIC PATIENTS

Spermatogenic cells were isolated by collagenase IV and cultured in Gamete medium supplemented with 50 IU l^-1 of FSH plus 1mmol l^-1. The medium were maintained in the culture at 32⁰C with 5% CO₂ in air for 24 hours.

The results showed that: It is effective in the treatment of azoospermic men.

-    Collagenase IV is effective in the isolation of spermatogenic cells.

-    The number of elongating spermatids, elongated spermatids and spermatozoa was increased. But the number of round spermatids reduced during the first day of culture.

-    Significant improvement of the rate of motile spermatozoa and motile elongated spermatids was observed after 24 hours.

-    An embryo was created after micromanipulation-assisted fertilization with in-vitro-cultured testicular spermatozoa.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Azoospermia là tình trạng không có tinh trùng trong tinh dịch. Trong các bệnh nhân azoospermia thì azoospermia không do tắc chiếm một tỷ lệ đáng kể, khoảng 50%. Các bệnh nhân này không thể có con của chính mình do không có tinh trùng, tinh tử trưởng thành ở mào tinh hay ống sinh tinh.

Ngày nay, với sự tiến bộ của các lĩnh vực khoa học như nuôi cấy tế bào, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, thì việc nghiên cứu nuôi cấy các tế bào dòng tinh có ý nghĩa vô cùng quan trọng, mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh nhân nhóm này.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

* Phân lập các tế bào dòng tinh

- Các nghiên cứu phân lập các tế bào dòng tinh đã được nghiên cứu từ rất lâu. Các nghiên cứu này được tiến hành ở trên cả người và trên động vật. Anna và cs, 1996 đã nghiên cứu và thành công quá trình phân lập các tế bào dòng tinh, đặc biệt là tinh nguyên bào loại A. Quá trình được tiến hành như sau: Chuột Wistar  9 ngày tuổi, trọng lượng cơ thể từ 18-20g được chọn để lấy tinh hoàn. Tinh hoàn được lấy và đặt trong môi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung glutamine (2nM), HEPES (15mM), một số amino acid, penicillin (100IU/ml), streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml). Sau khi loại bỏ màng trắng của tinh hoàn, mô tinh hoàn được đưa vào dung dịch nuôi cấy có khoảng 0,05% collagenase và dispase và 0,04mg/ml DNase, toàn bộ sản phẩm được đặt trong tủ ấm, ở nhiệt độ 32⁰C. Sau 10 phút các thành phần như mô liên kết được loại bỏ. Sản phẩm lại tiếp tục được để trong tủ ấm trong 15 phút nhằm tách các tế bào khỏi màng đáy. Sản phẩm lại tiếp tục cho vào môi trường nuôi cấy trong 20 phút, có 0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase IV. Sản phẩm thu được lại được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau đó là 50mm. Sau khi rửa 2 lần, ly tâm 800 vòng/phút trong 30 phút, sản phẩm thu được là các tế bào dòng tinh. Tác giả đã nuôi cấy các tế bào ở 32⁰C, nồng độ CO₂ là 5%.

- Hamra và cs, 2008 tiến hành phân lập các tế bào dòng tinh dựa vào nguyên tắc: các tế bào thân ở tinh hoàn sẽ gắn chặt với nền collagen trong môi trường nuôi cấy. Trong khi đó, các tế bào dòng tinh, trong môi trường nuôi cấy lại không có đặc tính đó.

* Nuôi cấy tế bào dòng tinh

-   Các nghiên cứu nuôi cấy các tế bào dòng tinh đã có từ rất lâu, Steinberger, 1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 là những tác giả đầu tiên tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh.

-   Tuy vậy, nuôi cấy các tế bào dòng tinh chỉ thực sự có ý nghĩa từ sau những năm 1990, khi kỹ thuật vi thao tác được áp dụng.

-   Ngày nay nuôi cấy tế bào dòng tinh với 2 mục đích:

+  Đối với azoospermia không do tắc:

-   Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 và Sousa, 2002, nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu đư­ợc từ TESE và nhận thấy: sau 24h nuôi cấy trong môi trường có FSH thì tỷ lệ di động và khả năng thụ tinh của tinh trùng tăng lên.

-   Aslam và Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 đã nuôi cấy các tinh tử của ng­ười có quá trình sinh tinh bình thường. Kết quả các tinh tử phát triển nhanh với các biểu hiện: nhân tụ đặc lại, đuôi hình thành và phát triển.

-   Terarik, 1998 nhận thấy sự có mặt của FSH và testosterone trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa.

-   Các nghiên cứu của Tesarik vào năm 1999 và 2000 cũng thu đ­ược kết quả tư­ơng tự ở bệnh nhân azoospermia không do tắc.

-   Năm 1999, đứa trẻ đầu tiên ra đời từ tinh tử nuôi cấy (Tesarik).

-   Cho đến nay, có nhiều phương pháp nuôi cấy các tế bào dòng tinh khác nhau. Tesarik, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh cùng với các tế bào Sertoli, trong điều kiện nhiệt độ từ 30-32⁰C, cùng với các chất khác như FSH, LH. Sousa, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh sau khi phân lập và chọn lựa dựa vào kỹ thuật vi thao tác. Một số các tác giả khác nuôi cấy các tế bào dòng tinh cùng với tế bào Vero.

-   Huleihel và cs, 2007 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào cùng với tế bào Sertoli, dung dịch nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy ngoài các nội tiết tố còn bổ sung các chất như GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell factor), LIF (leukemia inhibitory factor). Kết quả nghiên cứu cho thấy các tế bào phân chia tốt.

-   Perrard và cs, 2007 đã tiến tới nuôi cấy các tế bào dòng tinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực tiếp đến lần thứ 2 của phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử tròn. Chính vì vậy các tác giả nhận thấy số lượng tinh tử tròn tăng nhanh trong quá trình nuôi cấy.

-   Zhang, 2008 đã tiến hành nuôi cấy các tinh nguyên bào của chuột trên nền các tế bào Sertoli. Sau 4 đến 5 ngày nuôi cấy, môi trường nuôi cấy được thay. Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy đã phát hiện sự phân chia tế bào. Quá trình nuôi cấy được kéo dài trên 50 ngày.

-   Mito Kanatsu và cs, 2008 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào của chuột Hamster trong thời gian kéo dài. Các tinh nguyên bào sau khi được phân lập và nuôi cấy trong môi trường có NGF, kết quả của nghiên cứu thu được tinh tử tròn.

-   Gần đây một số tác giả đã tiến hành nghiên cứu biệt hoá các tế bào mầm gốc phôi thành noãn và tinh trùng như Lacham-Kaplan, 2008. Các tác giả này đã thu được một số thành công, tuy nhiên vẫn còn nhiều tồn tại cần nghiên cứu.

+  Đối với azoospermia do tắc:

-   Các bệnh nhân nhóm này có quá trình sinh tinh xảy ra bình thường. Thông thường, các bệnh nhân này có kích thước tinh hoàn, nồng độ FSH, LH và testosterone trong máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ. Đặc biệt, chúng ta có thể thu được tinh trùng và tinh tử trưởng thành tại mào tinh qua các kỹ thuật PESA, MESA (Silber, 1994).

-   Tuy vậy, các tế bào dòng tinh thu được tại đây thường chưa trưởng thành hoàn toàn, hơn nữa lại khó xác định được tế bào sống để lựa chọn. Một số tác giả đã tiến hành nuôi cấy các tế bào này và đạt được kết quả tốt đẹp như: tế bào biệt hóa, trưởng thành hơn, khả năng xác định tế bào sống cao và tỷ lệ thụ tinh sau ICSI tăng đáng kể (Balaban, 1999).

* Đặc điểm của các tế bào thu từ  tinh hoàn bệnh nhân azoospermia:

-   Tinh trùng th­ường chưa biệt hóa hoàn toàn và không di động nên rất khó xác định tinh trùng sống trong việc chọn tinh trùng để làm ICSI.

-   Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ đứt gãy ADN trong các tinh tử thu từ tinh hoàn, đặc biệt là tinh tử tròn (round spermatid) là rất cao, đây là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công.

-   Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh của tinh tử rất thấp (Tesarik):

Không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm một tỷ lệ đáng kể trong các nguyên nhân vô sinh nam và đây là nguyên nhân đáng quan tâm nhất. Nhóm azoospermia do tắc, các bệnh nhân này sẽ được điều trị bằng phương pháp PESA-ICSI hay MESA-ICSI. Nhóm thứ 2 là nhóm azoospermia không do tắc, các bệnh nhân này cho đến nay khó có khả năng điều trị. TESE-ICSI hoặc xin tinh trùng là hướng giải quyết cho các bệnh nhân nhóm này.

Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc, hướng giải quyết hiện nay vẫn là xin tinh trùng, đây vẫn là một giải pháp tình thế.

-   Chính vì vậy nuôi cấy tinh trùng, tinh tử và các tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh và mang lại cơ hội làm cha cho những bệnh nhân azoospermia.

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

3.1. Đối tượng nghiên cứu

3.1.1. Cỡ mẫu: bao gồm 30 bệnh nhân được chẩn đoán azoospermia tại Trung tâm Công nghệ phôi - Học viện Quân y

3.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:

-   Bệnh nhân có xét nghiệm nhiễm sắc thể bình thường

-   Sau khi tiến hành phương pháp PESA hoặc MESA, các bệnh nhân được xác định không có tinh trùng tại mào tinh.

-   Không tiến hành nuôi cấy các trường hợp chỉ có tế bào Sertoli trong ống sinh tinh (hội chứng chỉ có tế bào Sertoli).

3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

3.2.1. Vật liệu nghiên cứu:

+    Kính hiển vi đảo ngược vi thao tác Olympus IX 70 có gắn kính Hoffman của Nhật.

+    Tủ nuôi cấy CO₂ Forma, Mỹ.

+    Giếng nuôi cấy Nunc, loại 4 giếng.

+    Các dụng cụ thuỷ tinh: bao gồm lam kính đồng hồ, lam kính thường, lamen.

+    Các hoá chất: bao gồm dung dịch Gamete 100, Puregon, testosterone và collagenase IV

3.2.2. Phương pháp nghiên cứu:

3.2.2.1. Phương pháp xét nghiệm tinh dịch đồ (theo WHO, 1999) [8].

3.2.2.2. Phương pháp sinh thiết tinh hoàn mở (theo Thomas Wheeler, 1995) [7].

3.2.2.3. Phương pháp TESE (Testicular Sperm Extraction) (theo Tesarik, 2001 có cải tiến) [6]:

-     Mẫu tinh hoàn được thu từ sinh thiết mở tinh hoàn và được nghiền bởi 2 lam kính vô trùng.

-     Sản phẩm thu được cho vào dung dịch collagenase IV (1000IU/ml) ở 37⁰C, trong 30 phút.

-     Cặn lắng thu được sau ly tâm được rửa và cho vào môi trường Gamete 100.

3.2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào (theo Tesarik, 1998) [5]:

-     Nuôi cấy trong môi trường Gamete, có bổ sung FSH (50IU/l), testosterone (1mmol/l).

-     Quá trình nuôi cấy được tiến hành trong bóng tối, ở nhiệt độ 32⁰C, trong thời gian là 24h.

3.2.2.5. Phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn – ICSI (theo Palermo, 1992) [3].

3.2.2.6. Đánh giá số lượng các tế bào dòng tinh trong điều kiện nuôi cấy:

-    Xác định các tế bào dòng tinh (theo Sousa, 2002) [4].

-    Xác định số lượng các loại tế bào: tại mỗi thời điểm nuôi cấy, mỗi giếng nuôi cấy được đếm 20 vi trường, mỗi vi trường đếm từng loại tế bào, sau đó tính số lượng trung bình từng loại tế bào.

4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm bệnh nhân:

Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.1.

Bảng 4.1.

4.2. Kích thước tinh hoàn của bệnh nhân.

Bảng 3.2.

(K là hệ số thể tích)

Qua bảng 4.2. chúng ta có thể thấy kích thước tinh hoàn của bệnh nhân nhỏ hơn kích thước tinh hoàn của người bình thường.

4.3. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh sau 24h nuôi cấy.

Bảng 4.3.

Qua bảng 4.3. chúng ta có thể nhận thấy: sau 24h nuôi cấy số lượng tế bào Sertoli, tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II và tinh tử tròn giảm. Trong khi đó số lượng các tinh tử đang kéo dài và tinh tử đã kéo dài và tinh trùng tăng. Kết quả này cũng phù hợp với các tác giả khác như: Balaban và cs, (1999) (1); Movahedin và cs, (2004) (2).

4.4. Sự biến đổi chất lượng của tinh trùng và tinh tử đã kéo dài thu được từ TESE sau 24h nuôi cấy.

Bảng 4.4.

Qua bảng 4.4. chúng ta có thể nhận thấy tỷ lệ di động của tinh trùng, tinh tử đã kéo dài tăng đáng kể sau 24h nuôi cấy.

4.5. Đánh giá khả năng thụ tinh của tinh trùng thu được sau nuôi cấy.

Chúng tôi đã tiến hành tiêm tinh trùng thu được sau 24h nuôi cấy vào bào tương của noãn.

Bảng 4.5.

Từ kết quả trên chúng ta có thể nhận thấy: tinh trùng thu được sau 24h nuôi cấy có khả năng thụ tinh và tạo thành phôi.

Ngày nay, các bệnh nhân azoospermia do tắc nghẽn, tinh trùng có thể được lấy từ mào tinh để thực hiện IVF hoặc ICSI. Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc nghẽn, thì việc nuôi cấy các tế bào dòng tinh có ý nghĩa hết sức quan trọng, mở ra cơ hội mới cho các bệnh nhân nhóm này. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu với số lượng lớn hơn. Hiện nay, đã có một số tác giả đã thành công trong việc tạo tinh trùng từ tế bào gốc phôi, tuy vậy, chất lượng tinh trùng và phôi tạo được thường không bình thường.

5. KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu, bước đầu chúng tôi có thể kết luận như sau:

-    Collagenase IV có khả năng phân lập các tế bào dòng tinh hiệu quả

-    Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử đã kéo dài tăng cao ở thời điểm 24h sau nuôi cấy.

-    Các tinh tử có khả năng biệt hoá trong môi trường Gamete, ở 32⁰C, trong bóng tối.

-    Tinh trùng thu được sau 24h nuôi cấy có khả năng thụ tinh để tạo thành phôi.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Balaban, B., Urman, B., Sertac, A. et al.

In-vitro culture of spermatozoa induces motility and increases implantation and pregnancy rate after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection, Human Reproduction, Vol 14, no 11, 1999, pp 2808-2811.

2. Movahedin, M., Ajeen, A., Ghorbanzadeh, N. et al.

In vitro maturation of fresh and frozen-thawed mouse round spermatids, Andrologia, 36, 2004, pp 269-276.

3. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P. et al.

Pregnancy after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into oocyte, Lancet, 1992, pp17-18.

4. Sousa, M., Cremades, N., Silva, J., Oliveira, C. et al.

Predictive value of testicular histology in secretory azoospermic subgroups and clinical outcome after microinjection of fresh and frozen-thawed sperm and spermatids, Hu. Prod, Vol 17, no 7, 2002, pp 1800-1810.

5. Tesarik, J., Greco, E., Cohen-Bacrie, P., Mendoza, C.

Germ cell apoptosis in men with complete and incomplete spermatogenesis failure. Mol Hum Reprod, 4, 1998, pp 757-762.

6. Tesarik, J., Greco, E., Memdoza, C.

Assisted reproduction with in-vitro-cultured testicular spermatozoa in case of severe germ cell apoptosis: a pilot study, Human Reproduction, Vol 116, No 12, 2001, pp 2640-2645.

7. Thomas, M. Wheeler., Michael Coburn,

Testicular biopsy in male infertility evaluation. Infertility in the male, second edition, Mosby year book, 1996; 223-253.

8. WHO.

Who laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, Fourth edition, United Kingdom, 1999.