Hiện nay, vô sinh đang là vấn đề của toàn cầu. Ở nam giới, tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 40% và thường liên quan đến rối loạn chức năng sinh tinh. Đối với các bệnh nhân tinh trùng ít, không có tinh trùng,… một số biện pháp điều trị như phẫu thuật nhiều lần để thu nhận tinh trùng có thể ảnh hưởng đến sức khoẻ, tâm lý bệnh nhân; hoặc một số bệnh nhân điều trị ung thư lo ngại về các tác dụng phụ liên quan đến việc điều trị, ảnh hưởng đến chức năng sinh sản. Vì vậy, bảo tồn khả năng sinh sản khi điều trị là vô cùng quan trọng, trong đó trữ lạnh tinh trùng là biện pháp cứu cánh cho nhiều trường hợp bệnh nhân có vấn đề về sinh sản. Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật bảo quản tinh trùng thông thường hữu hiệu cho những trường hợp tinh trùng có chất lượng tốt, còn đối với tinh trùng số lượng ít việc bảo quản thông thường có thể làm ảnh hưởng đến mẫu như tỷ lệ thu hồi thấp, giảm độ di động,… Vì vậy, trữ đông tinh trùng số lượng ít bằng phương pháp thuỷ tinh hoá đang là xu hướng trong tương lai.

Điểm quan trọng trong việc trữ đông tinh trùng số lượng ít bằng phương pháp thuỷ tinh hóa là lựa chọn các dụng cụ chứa phù hợp để tạo thuận lợi cho quá trình lưu trữ cũng như sử dụng. Có 2 dạng vật chứa được sử dụng là vật chứa sinh học như màng trong suốt, volvox globator spheres… và vật chứa phi sinh học như cryoloops, cryotop, Sperm VD, cell-sleeper… Mỗi vật chứa đều có ưu, nhược điểm khác nhau và đang được nghiên cứu rộng rãi trên nhiều đối tượng khác nhau.

1. Một số dụng cụ chứa trong trữ lạnh tinh trùng số lượng ít
    

1. Trữ tinh trùng với màng ZP
    

Bảo quản tinh trùng số lượng ít lần đầu tiên được thực hiện bởi Cohen và cộng sự năm 1997. Màng trong suốt (ZP – zona pellucidae) từ người và động vật được sử dụng cho việc đông lạnh các tinh trùng đơn lẻ. Noãn được loại bỏ tế bào chất bên trong và tinh trùng được chuyển vào ZP bằng kim ICSI. Trước khi đông lạnh, ZP được giữ cân bằng với chất bảo quản lạnh (cryoprotective agents – CPA) thành phần glycerol, sau đó chuyển ZP có chứa tinh trùng vào cọng rạ và nhúng vào nitơ lỏng bảo quản. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành đông lạnh tinh trùng bằng ZP người, chuột, hamsters và các kết quả gần như không có sự khác biệt về chất lượng tinh trùng trước và sau khi rã đông, với tỷ lệ thu hồi tinh trùng sau rã khoảng 70-100% và tỷ lệ tinh trùng di động đạt >50% [1][2].

ZP có kích thước lớn nên là vật chứa được nhiều tinh trùng và dễ quan sát dưới kính hiển vi. Tuy nhiên, giới hạn của ZP là vật liệu sinh học. Khi loại bỏ tế bào chất từ noãn, các mảnh vỡ DNA có thể chưa được loại bỏ hoàn toàn, lưu lại và được chuyển vào noãn cho lần ICSI sau đó. Một số nguyên cứu cho rằng việc trữ lạnh tinh trùng bằng ZP cho tỉ lệ phục hồi chất lượng tinh trùng sau rã đông và tỉ lệ thụ tinh thấp do tinh trùng gắn vào ZP3 trên ZP cũng có thể gây ra phản ứng acrosome ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng [3]. Ngoài ra, việc sử dụng ZP trên người còn liên quan đến vấn đề đạo đức ở một số quốc gia; vì vậy, trong tương lai các nhà khoa học đang dần tìm kiếm vật liệu phi sinh học thay thế tương tự như ZP.

2. Cryoloops
    

Cryoloop là dụng cụ bao gồm một vòng tròn rỗng bằng nhựa mềm, gắn với cán nhựa hoặc kim loại. Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành một lớp màng mỏng trong phần rỗng của vòng trong và tinh trùng/phôi được đặt lên trên màng mỏng này, sau đó toàn bộ dụng cụ chứa đặt trong nitơ lỏng. Năm 2004, Desai và cộng sự tiến hành trữ tinh trùng thu nhận từ mào tinh và tinh hoàn bằng cryoloop. Tinh trùng được bảo quản trong chất bảo quản lạnh CPA trong vòng 10-15 phút và chuyển lên cryoloop bằng kim ICSI. Đặt cryoloop lên hơi lạnh trong vòng 5 phút và nhúng vào nitơ lỏng. Sau đông lạnh, tinh trùng được rã đông bằng cách cắt cryoloop trong môi trường chứa tinh trùng và rửa sạch tinh trùng khỏi chất bảo quản lạnh. Kết quả cho thấy sau khi rã đông, tỉ lệ di động của tinh trùng ở thủy tinh hóa tương tự với đông lạnh chậm, đạt khoảng 70%; tỷ lệ thụ tinh đạt 60-70% [4]. Cryoloop giúp bảo quản được tinh trùng số lượng ít, đơn giản, loại bỏ các bước rửa tinh trùng và có thể thay thế cho việc trữ tinh trùng bằng ZP. Tuy nhiên, đây là hệ thống đông lạnh hở nên nguy cơ lây nhiễm chéo dễ xảy ra cho các mẫu đông lạnh.

3. Cell- sleeper
    

Cell-sleeper là hệ thống đông lạnh kín, dùng đông lạnh tinh trùng số lượng ít. Endo và cộng sự (2012) tiến hành đông lạnh tinh trùng từ mẫu xuất tinh trên Cell-sleeper. Kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng thu hồi đạt 100%, tỷ lệ tinh trùng di động đạt 28% [5]. Và năm 2016, khi tiến hành đông lạnh với mẫu thu nhận từ tinh hoàn, tỷ lệ thu hồi đạt 94%, tỷ lệ di động 56% và thụ tinh đạt 66% [6].

4. Cryotop
    

Cryotop được sử dụng phổ biến ở khoảng 40 quốc gia (700 trung tâm IVF) và hơn 100000 trường hợp trữ noãn, phôi. Vật liệu tạo ra cryotop từ nhựa cứng, có thể chống lại sự phá hủy cơ học vật lý và chống nhiễm virus từ bình chứa nitơ lỏng nên an toàn cho mẫu chứa. Vì vậy, cryotop được sử dụng chủ yếu trong các trung tâm điều trị IVF hiện nay. Yuji Endo và cộng sự (2011) đông lạnh tinh trùng thu từ tinh dịch và tinh hoàn bằng cryotop. Kết quả sau rã đông tỉ lệ sống tinh trùng đạt 98%, tinh trùng di động đạt 30,6%. Nhóm nghiên cứu cho thấy đông lạnh tinh trùng từ tinh dịch và từ tinh hoàn cũng cho kết quả tương tự, tỉ lệ thu hồi tinh trùng đạt 90-95%, số tinh trùng di động 42-45%. Tuy nhiên, khi đông lạnh bằng cryotop với các hóa chất đông lạnh khác nhau cho tỉ lệ tinh trùng di động khác nhau, với sucrose tỉ lệ tinh trùng di động đạt 65,3%, với spermfreeze độ di động chỉ đạt 37,5% [9].

5. Vi giọt
    

Để bảo quản tinh trùng số lượng nhỏ, các nhà khoa học đã thực hiện đông lạnh tinh trùng bằng vi giọt. Tinh trùng được đông lạnh với hỗn hợp CPA (50µl hoặc 100µl) trên bề mặt đá khô hoặc mảnh kim loại, sau đó nhúng vào nitơ lỏng. Kết quả sau rã đông cho tinh trùng di động thấp hơn 40% so với mẫu đông lạnh bình thường. Quintans và cộng sự (2000) thực hiện đông lạnh tinh trùng bằng vi giọt trong đĩa cấy nhựa, sau đó đĩa cấy được bọc căng nhựa để bảo vệ và nhúng vào nitơ lỏng, kết quả tỉ lệ phục hồi tinh trùng sau rã đông cao 90-100%. Năm 2008, Sereni và cộng sự cũng thực hiện đông lạnh tinh trùng bằng vi giọt, cho tỉ lệ thu hồi sau rã đông 100%, di động 65%; thực hiện ICSI, chuyển phôi 3 lần và có một lần thai sinh hóa [10].

6. Closed slice
    

Đây là phương pháp đông lạnh kín bằng việc sử dụng mảnh polypropylen chứa tinh trùng và ống chứa mảnh kim loại này. Phương pháp này được sử dụng cho mẫu ở bệnh nhân bị vô sinh do tắc nghẽn ống sinh tinh và cho tỷ lệ thu hồi tinh trùng đạt 92%, tỷ lệ sống đạt 66% [7].

7. The novel sperm vitrification device (SpermVD)
    

Với dụng cụ chứa là Sperm VD, tinh trùng cần lọc rửa sau đó load lên đĩa petri 90 với nhiều giọt nhỏ 10µl, ống mao dẫn có chứa PVP hút tinh trùng di động bằng hệ thống vi thao tác rồi chuyển qua giọt môi trường gom tinh trùng. Đĩa SpermVD có môi trường đông lạnh CPA trên các giếng đặt vào đĩa Petri 90 có chứa tinh trùng, bằng hệ thống vi thao tác chuyển giọt gom tinh trùng vào các giếng. Tiếp theo, đĩa SpermVD đặt vào trong cryovial có ghi tên bệnh nhân khóa lại và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, cất lưu trữ. Rã mẫu tinh trùng sử dụng bằng cách tháo khóa cryovial và đặt đĩa SpermVD trong đĩa petri 90 chứa dầu; để ở nhiệt độ phòng cho đến khi giọt môi trường chứa tinh trùng trong đĩa rã hoàn toàn trong dầu. Hệ thống vi thao tác hỗ trợ hút tinh trùng và tiến hành ICSI với noãn. Năm 2018, nghiên cứu của Berkovitz và cộng sự khi trữ tinh trùng bằng Sperm VD đã cho kết quả thu được như sau: tỷ lệ thu hồi tinh trùng sau rã đối với trữ bằng đĩa VD chiếm 96%; tỷ lệ tinh trùng di động sau rã chiếm 33%. Tỷ lệ thai lâm sàng 55%, tỷ lệ sinh sống 32% và tỷ lệ sẩy thai chiếm 29%. Tác giả nhận định rằng, mẫu lưu trữ đa phần là những mẫu tinh trùng lấy từ tinh dịch và mẫu lưu trữ không có tinh trùng bất động; do đó, hiệu quả đĩa SpermVD chỉ mang tính cung cấp phương án lựa chọn cho những trường hợp tinh trùng thu được số lượng rất ít. Phương pháp này giúp cải thiện tỷ lệ thai lâm sàng nhưng còn hạn chế là tỷ lệ tinh trùng di động sau rã đông còn thấp. Tuy nhiên, đây là loại dụng cụ thiết kế đơn giản, quy trình dễ thực hiện, có tiềm năng ứng dụng cao trong trữ đông tinh trùng số lượng ít, đặc biệt có thể giảm các trường hợp TESE lại đối với những bệnh nhân có số lượng tinh trùng ít [8].

2. Một số vấn đề liên quan đến trữ lạnh tinh trùng số lượng ít

Trữ lạnh tinh trùng số lượng ít bằng phương pháp thuỷ tinh hoá là một hướng nghiên cứu mới. Vì vậy có nhiều vấn đề còn đang bàn luận cho phương pháp này. Một câu hỏi đặt ra là trữ đông tinh trùng số lượng ít trên hơi hay thả trực tiếp trong nitơ lỏng sẽ tốt hơn? Nhóm tác giả Akram Hosseini và cộng sự (2019) đã so sánh hiệu quả của phương pháp thủy tinh hóa với hai quy trình: trữ đông tinh trùng trong nitơ lỏng LN2 (direct submerging - DS) và hơi nitơ LN2 (vapour - V). Tiến hành lọc rửa tinh trùng bằng kỹ thuật swim-up trước khi tiến hành đông lạnh và mẫu được chia thành hai nhóm: nhóm đối chứng và nhóm trữ đông. Nhóm trữ đông được chia thành hai nhóm khác: trữ đông bằng cách thả trực tiếp vào nitơ lỏng LN2 (nhóm DS) và trữ đông bằng hơi nitơ (nhóm V). Ở nhóm V, cryotop được đặt trên bề mặt của LN2 với khoảng cách 4cm trong 15 phút. Các mẫu tinh trùng sau đó được rã đông và đánh giá các chỉ số về độ di động, tỉ lệ sống, acrosome, nhiễm sắc thể và tính toàn vẹn DNA tinh trùng. Kết quả cho thấy khả năng di động và tỉ lệ sống của tinh trùng giảm đáng kể sau khi thủy tinh hóa so với nhóm đối chứng (p<0.05). Ở nhóm trữ đông, độ di động của tinh trùng ở nhóm DS cao hơn so với nhóm V (p<0,05), tỉ lệ sống sau rã đông ở cả hai nhóm DS và V không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tính toàn vẹn của acrosome và DNA tinh trùng giảm đáng kể sau khi thủy tinh hóa ở nhóm trữ đông so với nhóm đối chứng. Tỉ lệ tổn thương nhiễm sắc thể ở nhóm V cao hơn đáng kể so với nhóm DS, tương ứng 46,84% ở nhóm V và 38,84% ở nhóm DS (p<0,05). Như vậy, nghiên cứu cho thấy sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong đông lạnh tinh trùng số lượng ít có những thay đổi về chỉ số tinh trùng có thể chấp nhận được. Hạn chế của nghiên cứu là cỡ mẫu thấp, do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn trong tương lai nhằm tìm ra phương pháp đông lạnh tinh trùng hiệu quả đối với nhóm bệnh nhân có số lượng tinh trùng ít [11].

Một câu hỏi khác được đặt ra là nên sử dụng CPA trong trữ lạnh tinh trùng hay không? Việc sử dụng thủy tinh hóa tinh trùng không có CPA có phù hợp với IVF không? Phương pháp thủy tinh hóa là một quá trình chuyển hóa nước thành dạng thủy tinh, hạn chế hình thành tinh thể đá trong quá trình đông lạnh. Để đạt được điều kiện như vậy phải sử dụng chất bảo quản đông lạnh với nồng độ cao và tốc độ làm lạnh cực nhanh. Tuy nhiên, việc sử dụng CPA nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng sau rã đông và điều này vô cùng bất lợi cho những trường hợp có mật độ tinh trùng thấp. Nghiên cứu của Widyastuti và cộng sự (2017) đánh giá ảnh hưởng của CPA trong đông lạnh tinh trùng bằng thuỷ tinh hoá. Mỗi mẫu tinh dịch được chia làm 3 nhóm: nhóm chứng P1, nhóm P2 chỉ pha loãng với môi trường không có chất bảo quản lạnh, nhóm P3 pha với môi trường có chất bảo quản lạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy chất lượng của tinh trùng sau rã bằng phương pháp thủy tinh hóa ở cả 2 nhóm P2 và P3 đều thấp hơn so với nhóm chứng. Chất lượng của tinh trùng với chất bảo vệ ở nhóm P3 (di động 56%, sống 58,15%) thì cao hơn đáng kể so với P2 (di động 35%, sống 48%). Trong nghiên cứu này, nhóm P3 sử dụng thêm 0,25M sucrose và 1% HAS hoạt động như CPA không thẩm thấu có khả năng bảo vệ màng tế bào khi đông lạnh, dẫn đến tỉ lệ sống cao hơn so với nhóm không sử dụng CPA (P2). Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cho thấy đông lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không sử dụng CPA có thể được ứng dụng và nên khuyến khích sử dụng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [12].
 
Tài liệu tham khảo chính
[1]      P. E. Levi-Setti, E. Albani, L. Negri, A. Cesana, P. Novara, and S. Bianchi, “Cryopreservation of a small number of spermatozoa in yolk-filled human zonae pellucidae,” Arch. Ital. di Urol. e Androl., 2003.
[2]      Y. Y. Hsieh, H. Der Tsai, C. C. Chang, and H. Y. Lo, “Cryopreservation of human spermatozoa within human or mouse empty zona pellucidae,” Fertil. Steril., 2000.
[3]      J. Cohen, G. J. Garrisi, T. A. Congedo-Ferrara, K. A. Kieck, T. W. Sehimmel, and R. T. Scott, “Cryopreservation of single human spermatozoa,” Hum. Reprod., 1997.
[4]      T. G. Schuster, L. M. Keller, R. L. Dunn, D. A. Ohl, and G. D. Smith, “Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops,” Hum. Reprod., 2003.
[5]      Y. Endo, Y. Fujii, K. Shintani, M. Seo, H. Motoyama, and H. Funahashi, “Simple vitrification for small numbers of human spermatozoa,” Reprod. Biomed. Online, 2012.
[6]      K. Coetzee, K. Ozgur, M. Berkkanoglu, H. Bulut, and A. Isikli, “Reliable single sperm cryopreservation in Cell Sleepers for azoospermia management,” Andrologia, 2016.
[7]      J. B. Ma C, Hu MG, “Application of closed slice method in cryopreservation of testicular spermatozoa,” Contemp Chin Med, vol. 24, pp. 19–21, 2017.
[8]      A. Berkovitz, N. Miller, M. Silberman, M. Belenky, and P. Itsykson, “A novel solution for freezing small numbers of spermatozoa using a sperm vitrification device,” Hum. Reprod., 2018.
[9]      Y. Endo, Y. Fujii, K. Shintani, M. Seo, H. Motoyama, and H. Funahashi, “Single Spermatozoon Freezing Using Cryotop,” J. Mamm. Ova Res., 2011.
[10]    E. Sereni et al., “Freezing spermatozoa obtained by testicular fine needle aspiration: A new technique,” Reprod. Biomed. Online, 2008.
[11]    A. Hosseini et al., “Cryopreservation of Low Number of Human Spermatozoa; Which is Better: Vapor Phase or Direct Submerging in Liquid Nitrogen?,” Hum. Fertil., vol. 22, no. 2, pp. 126–132, 2019.
[12]    R. Widyastuti, R. Lesmana, A. Boediono, and S. H. Sumarsono, “Effect of cryoprotectants on sperm vitrification,” Adv. Biomol. Med. - Proc. 4th BIBMC (Bandung Int. Biomol. Med. Conf. 2016 2nd ACMM (ASEAN Congr. Med. Biotechnol. Mol. Biosci. 2016, no. March, pp. 119–122, 2017.
 
 

Từ khóa: Trữ lạnh tinh trùng số lượng ít